离体猪肺生物膜模型：一种用于研究猪细支气管组织上细菌生物膜的肺部模型构建技术

细支气管是肺部的管状气道。在慢性感染过程中，由于黏液积聚，细支气管会堵塞。富含营养的黏液为机会性细菌的生长提供了适宜的环境。这些细菌嵌入其自身产生的胞外多糖基质中，并增殖形成生物膜。

为了模拟细菌生物膜在肺部的发育过程，取猪支气管组织样本置于培养皿中。将组织解剖成所需形状的小块。向培养皿中加入生物膜培养基。在紫外线下对培养皿进行灭菌，以去除任何表面污染物。

将灭菌的组织块转移至含有生物膜培养基和琼脂糖垫的多孔板中，琼脂糖垫可作为细菌黏附的理想基质。接着，用含有目标细菌菌落的针尖刺入每块组织，以将浮游细菌接种到组织中。使用经紫外灭菌的多孔膜密封多孔板，以促进整个板表面的均匀氧气交换。将密封后的多孔板进行孵育。 

孵育过程中，细菌通过菌毛不可逆地黏附于上皮表面，并开始分泌胞外基质。  在基质中，细菌利用培养基中的能量来源、黏蛋白以及游离DNA形成生物膜。细菌生物膜模型现已可用于进一步检测。

将细支气管放入第一份 DMEM/RPMI 1640 洗涤液中。将其留在洗涤液中，并从同一肺组织中采集额外的细支气管节段，以获得计划实验所需的足够组织样本。将来自同一肺组织的其他细支气管节段也放入洗涤液中，并在洗涤液中至少保留两分钟。

从第一次清洗液中取出细支气管，将样本置于无菌培养皿中。用无菌镊子轻轻夹住每条细支气管，注意避免损伤组织。尽可能去除残留的软组织，并使用无菌解剖剪将组织切成宽度为5 mm的条状。

将所有细支气管组织条放入第二份DMEM/RPMI 1640洗涤液中，静置至少两分钟。然后用无菌镊子取出第二份洗涤液中的组织条，放入一个干净且无菌的培养皿中。去除附着在细支气管上的任何残留软组织，并使用无菌解剖剪将组织条剪成小块。

将第三次的DMEM/RPMI 1640洗涤液加入培养皿中，通过轻轻旋转培养皿使组织块在洗涤液中轻微混匀。倒出第三次洗涤液时保留组织块，不要将其移除。

然后加入最终的SCFM洗涤液，确保所有组织块均被覆盖。在紫外光下用SCFM对组织进行5分钟的灭菌。使用无菌镊子将每一块灭菌后的支气管组织转移至含有SCFM琼脂糖垫的24孔板的各个孔中。

为了用目标菌株感染每块组织，使用连接在无菌0.5毫升胰岛素注射器上的29号针头尖端接触在琼脂平板上生长的菌落，然后将该菌落接触至组织块表面，轻轻刺破表面。对于未感染的对照组，仅用针头尖端轻轻刺破组织块表面即可。

然后，使用移液器向每个孔中加入 500 µL SCFM。将每个 24 孔板的透气密封膜在紫外线下灭菌 10 分钟。取下 24 孔板的盖子，换上透气膜。随后，将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中静置培养。