激光辅助选择性消融猪角膜内皮细胞：一种用于离体研究的聚焦性猪角膜内皮损伤诱导技术

猪角膜最内层——透明无血管的眼前部结构——由角膜内皮细胞（CECs）构成，这些细胞附着于基底膜（即后弹力层，DM）之上。CECs 维持角膜的透明性及最佳视力，任何对其造成的损伤都可能影响视力。

为实现选择性角膜内皮细胞损伤，需从新鲜摘取的猪眼开始，并将其置于合适的培养基中。去除周围组织后，用适当的消毒剂处理眼球，以消除表面微生物污染。经生理盐水冲洗后，在激光照射前光学检查眼前节，排除任何异常情况。

将眼球固定在定制的夹持装置中，置于配备特定波长激光器的裂隙灯装置前方。观察角膜的各层结构。通过调节适当的激光能量和焦点位置，将激光脉冲定向至角膜内皮层。这种聚焦的短持续时间、高功率脉冲可选择性地使暴露表面的角膜内皮细胞破裂，同时避免热扩散，从而保护后弹力层（DM）或基质组织。

在靠近角膜缘（角膜与巩膜交界处）的位置创建一个进入口，向包含角膜的前房内注射粘弹剂溶液，以稳定角膜并保护剩余的角膜内皮细胞（CEC）。切除经激光处理的角膜片段，并将其转移至含有培养基的多孔板中，使 CEC 面朝上。该离体角膜内皮损伤模型可用于进一步的研究。

从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼后，将样品置于4摄氏度的完全培养基中。使用剪刀去除细胞外组织，并将眼球在5%聚维酮碘眼用溶液中浸泡五分钟。随后，将消毒后的样品置于室温下的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。

使用谱域光学相干断层扫描仪，对眼部进行主要眼前节病变的筛查，例如角膜瘢痕、水肿及其他混浊。筛查后，将眼睛置于配备有波长为1064纳米、空气中焦点光斑直径为10微米的Nd:YAG激光器的裂隙灯装置前方。选择12倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜的各层结构。

在将脉冲能量和焦点位置调整至适宜参数以选择性消融角膜内皮细胞后，对组织施加数次激光脉冲。随后，在解剖显微镜下，于角膜缘附近进行透明角膜穿刺，并注入粘弹性物质以稳定眼内腔。接着，使用直径为8毫米的角膜环钻切除经激光处理的中央角膜，将分离的角膜置于12孔板的一个孔中，内皮面朝上。当所有角膜样本收集完毕后，向每个样本孔中加入3毫升完全培养基，并在37°C条件下孵育最多三天。