猪主动脉内皮细胞（pAEC）分离：一种基于酶消化法从收获的猪腹主动脉中分离内皮细胞的方法

主动脉——将含氧血液从心脏输送至全身的主要动脉——由三层结构（即“膜”）组成：内层的内膜、中层的中膜以及外层的外膜。内膜中存在内皮细胞（ECs），它们在主要由胶原等结构蛋白构成的支持性基底膜上形成一层薄而连续的单细胞层。

为了分离内皮细胞（ECs），首先将收获的猪主动脉置于培养皿中。切除其两端及周围任何附着组织，以防止非内皮细胞污染。用含有抗生素的缓冲液清洗主动脉，以抑制微生物生长。

将无菌外科缝线穿过主动脉，并打结固定其中一端，使缝线保留在管腔内。固定打结端并牵拉缝线，使主动脉完全翻转，从而暴露含有内皮细胞的内膜，以便进行酶消化处理。使用预热的低浓度胶原酶溶液处理主动脉，以保证酶的最佳活性，并进行孵育。

胶原酶可降解内皮细胞下方基底膜中存在的胶原蛋白，从而启动细胞的解离。孵育结束后，加入预冷的缓冲液以灭活胶原酶。

轻轻刮取主动脉内膜表面，并用缓冲液冲洗，以将内皮细胞（ECs）释放到溶液中。离心该溶液以沉淀内皮细胞。将沉淀重悬于适当的培养基中。将细胞悬液接种至培养瓶中并进行培养。内皮细胞会贴附于培养瓶底部并增殖。

分离猪主动脉内皮细胞时，将猪主动脉在无菌条件下转移至150毫米的培养皿中，轻轻去除血管两端。用无菌镊子和剪刀修剪血管夹持部位多余的组织，并使用20至50毫升新鲜洗涤缓冲液冲洗主动脉的内外表面。

接下来，将外科缝线穿过主动脉，并松散地结扎血管的一端，使缝线保留在管腔内。用镊子轻轻固定结扎端附近的主动脉，然后缓慢牵拉外科缝线，使主动脉翻转，直至暴露主动脉的内皮表面。

用10毫升新鲜洗涤缓冲液清洗主动脉内皮表面三次，每次清洗后将主动脉放入一个15毫升离心管中。加入10毫升预热至37摄氏度的0.005% IV型胶原酶消化液覆盖组织样本，在37摄氏度下孵育15分钟。

孵育结束后，将整个试管内容物转移至100毫米的培养皿中，并加入10至15毫升预冷的终止缓冲液以终止消化反应。使用细胞刮棒轻轻刮下血管内壁的主动脉内皮细胞，并用5毫升洗涤缓冲液洗涤血管三次，每次洗涤使用5毫升。

最后一次洗涤后，将上清液转移至一个50毫升离心管中，每次用5毫升新鲜洗涤缓冲液洗涤培养皿底部，共洗涤两次，将洗涤液汇集至该50毫升离心管中。

通过离心收集细胞，弃去上清液，仅保留最后10毫升。加入20毫升洗涤缓冲液重悬沉淀，注意避免产生气泡，再通过另一次离心收集细胞。

将沉淀重悬于1毫升细胞培养基中进行计数，并以每25平方厘米培养瓶1 × 10⁶个细胞的浓度接种细胞。随后将细胞置于37°C、5%二氧化碳的细胞培养孵箱中培养，每2至3天更换一次培养基。