体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

从永生化的造血干细胞和祖细胞（iHSPC）开始，在含有特定类固醇激素和造血细胞因子的培养基中进行培养，以调控细胞在未分化状态下的增殖。加入适量的阳离子聚合物和慢病毒载体。

重组病毒携带针对特定宿主基因和抗生素抗性标记基因的短发夹RNA（shRNA）编码序列。

离心以沉淀细胞和病毒。在孵育过程中，阳离子聚合物中和细胞膜电荷，增强病毒结合。膜融合后，病毒的遗传物质和酶释放到细胞质中。病毒基因组发生逆转录，进入细胞核，并整合到宿主基因组中。

在构建体中特定启动子的作用下，包含与靶标mRNA匹配序列、环状片段以及另一段与前者互补的序列的shRNA基因构建体被转录，形成具有未配对核苷酸环状片段的shRNA。转录完成后，shRNA被转运至细胞质中。

一种特异性的核糖核酸酶切割环状片段，形成双链RNA，即小干扰RNA（siRNA）。siRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，siRNA双链随之解离。保留的单链与靶标mRNA互补配对，该活化的复合体以序列特异性方式识别并结合靶标mRNA，负向调控其表达，介导靶基因的抑制。

用特定的抗生素孵育细胞。稳定转导的细胞表达抗生素抗性基因，从而实现筛选。更换培养基并继续孵育，使稳定转导的细胞增殖。

首先，将永生化的造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）维持在完全RPMI 1640培养基中，培养基中添加100 纳克/毫升 Flt3配体和1 微摩尔 β-雌二醇。进行慢病毒转导时，将iHSPCs以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入含有Flt3配体、β-雌二醇和polybrene的1 毫升完全培养基。

然后，按感染复数为100的标准，向每孔加入携带短发夹RNA的慢病毒。接着，将培养板在37摄氏度、1,100 × g 条件下离心90分钟。随后，将感染后的细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，通过将细胞收集至15毫升离心管并进行离心，去除聚凝胺，随后更换为含有Flt3配体和β-雌二醇的新鲜完全培养基。

再过 24 小时后，向培养基中加入 6 微克/毫升的嘌呤霉素以筛选感染的细胞。每三天更换一次筛选培养基，并持续培养细胞至少一周，以扩增稳定转导的 iHSPCs。