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生物学技术
0 次观看 • 5:12 分钟 • July 8th, 2025
首先，将一体式CRISPR质粒加入试管中存在的免疫细胞中。该质粒包含Cas9基因，以及与宿主基因组中靶序列互补的sgRNA（单导向RNA）编码序列。
加入线性化的供体质粒，该质粒包含位于同源臂（HAs）之间的转基因序列——同源臂是实现同源重组所需的DNA重复序列。进行电穿孔操作，利用电流将质粒混合物导入细胞内。进入细胞后，经加工的sgRNA与表达的Cas9核酸酶结合形成复合物。
sgRNA 与靶位点结合，使 Cas9 核酸酶能够识别被称为原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的特异性识别序列，并在其附近切割宿主 DNA。这产生一个平末端的双链断裂，细胞机制随后对 DNA 进行切除，生成 3' 突出端。两侧存在同源臂（HA）序列会触发同源定向修复机制，使断裂的 DNA 与 HA 序列连接，形成杂合双链结构——D 环（D-loop）。
DNA 合成持续进行，形成与转基因序列互补的链，直至重新连接到原始 DNA 链。D 环顶端作为模板，合成 DNA 缺失的部分，产生双霍利迪连接（double Holliday junctions）——即四条 DNA 链相互作用的结构。这些连接结构随后得以解析，缺口被修复，从而促进靶基因的插入。
在24孔板的每个孔中加入500微升不含抗生素的完全生长培养基。将该培养板置于加湿的37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中预热。打开电穿孔系统。输入适用于JURKAT或RAW细胞的电穿孔参数。
准备用于电穿孔的细胞-DNA混合物。收集25平方厘米培养瓶中的JURKAT细胞培养物，转移至50 mL离心管中。随后在室温下以90 × g 离心8分钟，使细胞沉淀。
对于上清液，用5 mL DPBS重悬细胞以进行洗涤。然后，在与前一步骤相同的条件下，通过离心处理细胞悬液。弃去DPBS，并用2 mL DPBS重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液，与等体积的0.2%台盼蓝混合。
为估算细胞数量，将样品加入此计数载玻片中。将计数载玻片插入自动细胞计数仪，观察细胞图像，然后获得细胞计数结果。每次基因敲入实验需进行5次电穿孔，每次按200万细胞进行计算。
将所需数量的细胞转移至1.5 mL离心管中，通过离心沉淀细胞。为节省时间，可在离心过程中配制电穿孔混合物。在新的1.5 mL离心管中，加入2.5 µg的CRISPR-Cas9载体、2.4 µg的线性化靶向载体以及重悬缓冲液R，总体积为55 µL。
轻轻涡旋混匀，并短暂离心以充分混合。将电穿孔混合物在室温下放置备用。离心后，吸除DPBS，再额外离心30秒。尽可能彻底去除上清液。加入制备好的电穿孔混合物重悬细胞，轻轻吹打混匀。
电穿孔： 对于细胞电穿孔混合物，使用10微升的核转染吸头配合移液器操作。
重要提示：移液过程中避免产生气泡，否则将导致电穿孔失败。按下“开始”。
电穿孔后，将样品转移至含有预热培养基的24孔板的一个孔中。对剩余的4个重复样品执行与上述相同的电穿孔操作。轻轻摇动培养板，以确保细胞均匀分布。将细胞在37°C培养箱中孵育48至72小时，然后进行FACS细胞分选。