0 次观看 • 4:34 分钟 • July 8th, 2025
对于将小干扰RNA（siRNA，一类双链RNA）反向转染至非贴壁脂肪细胞时，需制备针对脂肪细胞中特定蛋白编码基因的siRNA悬浮液。加入适量的阳离子脂质类转染试剂，孵育混合物，通过静电相互作用形成转染复合物。
将混合物转移至包被有胶原的多孔板孔中。转染复合物通过非特异性相互作用固定在孔板的包被层上。用移液器将脂肪细胞悬液加入含有固定化转染复合物的孔中。脂肪细胞松散地黏附于孔板包被层，从而增加细胞与复合物之间的物理接触。
转染复合物与细胞膜融合，并将siRNA递送至细胞质中。该siRNA由一条与靶标mRNA序列互补的反义链和一条有义链组成，可被多蛋白RNA诱导沉默复合物（RISC）识别。siRNA与RISC结合后，双链解离，反义链保留在复合物中。
激活的siRNA-RISC复合物识别并结合靶mRNA上的互补位点。这导致RISC复合物中的Argonaute蛋白对mRNA进行序列特异性的切割。被切割的mRNA随后被细胞机制进一步降解，从而沉默靶基因的表达。
用改良的最低必需培养基混悬siRNA，室温孵育5分钟。向siRNA中加入转染试剂和改良的最低必需培养基，用移液器混匀。室温孵育20分钟。然后，将转染混合物加入至包被有胶原的培养板的每孔中。
用 DPBS 将 100 毫米培养皿中的细胞洗涤两次。向细胞中加入 5X 胰蛋白酶，确保胰蛋白酶覆盖整个培养皿表面。等待 30 秒后，小心吸除胰蛋白酶。将培养皿置于 37 ℃ 培养箱中孵育 5 至 10 分钟。
然后轻敲培养皿以使细胞脱落，避免损伤细胞。加入10毫升不含丙酮酸盐的DMEM培养基，含25 mM葡萄糖、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，以中和胰蛋白酶。小心地反复吹打培养基，使细胞完全脱落并混匀细胞悬液。
使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至 6.25 × 105 个细胞/mL 培养基。每孔加入 800 微升细胞悬液至 12 孔板中，或每孔加入 400 微升细胞悬液至含有转染混合物的 24 孔板中。
将培养板放入细胞培养箱中孵育，24 小时内不要扰动。次日，小心弃去上清液，更换为新鲜的 DMEM 培养基（不含丙酮酸，含 25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素-链霉素），然后将细胞重新放回培养箱中。