可诱导的 Tet-Off 调控系统：利用四环素-关闭系统在培养细胞中进行基因表达调控的体外方法

首先，取一管含有培养的受体细胞的悬浮液。向该管中加入含有目的基因的可诱导质粒。该基因的表达受上游启动子序列与四环素操纵子（TetO）融合形成的四环素反应元件（TRE）调控。

此外，加入四环素负调控载体，每种载体均包含编码重组四环素转录激活蛋白（tTA）的基因。通过电穿孔法将细胞与DNA混合物进行电击处理，利用电脉冲促进细胞对质粒的摄取。

电穿孔后，将细胞接种并孵育所需的时间。当进入细胞核后，四环素关闭型载体表达 tTA 蛋白。tTA 是一种杂合蛋白，包含四环素阻遏蛋白（TetR）或 TetR 片段以及病毒 VP16 转录激活域。

TetR 结合域与 TRE 元件中的 TetO 序列结合，而 VP16 结构域则促进 RNA 聚合酶从下游 DNA 转录 mRNA，最终导致基因表达。将培养板中的培养基更换为含多西环素的培养基，并进行孵育。

多西环素——一种合成的四环素类似物——可与四环素阻遏蛋白（TetR）结合并改变其构象。这种构象变化会破坏TetR蛋白与TetO序列的相互作用，从而抑制目的基因的表达。

将细胞以 1 × 10⁶ 个细胞/cm² 的密度接种于 100 毫米的培养皿中，加入完全最低必需培养基。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳及湿度条件下培养 24 小时。次日，在新的 12 孔板的每孔中加入 500 微升不含抗生素的完全培养基，并在 37 摄氏度下预热 30 分钟。

孵育期间，向每个孔对应的1.5毫升离心管中加入1微克报告质粒和1微克调控载体。用每孔10毫升、37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤肺泡上皮细胞，并在细胞培养孵箱中用每孔5毫升、37摄氏度、0.05%的胰蛋白酶处理细胞2至4分钟。

当细胞脱落后，用每孔10毫升不含抗生素的完全培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集到一个新的50毫升离心管中。用4毫升新鲜培养基洗涤培养皿，以收集残留的细胞，并通过离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于1毫升PBS中用于计数，并再次离心细胞。用重悬缓冲液将沉淀重悬至浓度为4 × 10⁷ 个细胞/毫升，取4 × 10⁵ 个细胞加入至每管质粒和载体中，轻轻混匀。取1管放入电穿孔仪中，并向管内加入3.5毫升电转缓冲液。

完全压下活塞，将镀金电极尖端插入移液管，并轻轻混匀管内物质。用移液管小心吸取细胞，并将移液管插入电穿孔仪中，直至听到咔嗒声。选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，然后按下触摸屏上的开始按钮。

转染后立即移除移液器，并将细胞转移至预热的12孔板中的一个孔内。待所有细胞完成电穿孔并接种后，将培养板放入细胞培养箱中培养，并在两天后用含抗生素的完全培养基更换每孔中的上清液。转染是否成功可通过EGFP的表达来验证，使用对照载体通过荧光显微镜观察或流式细胞术进行检测。

为了抑制目的基因的转录，在转染后72小时，将每孔上清液更换为1毫升含1微克/毫升新鲜配制的多西环素的完全培养基。为了评估目的基因mRNA的半衰期，将培养板放回细胞培养箱中孵育15分钟至6小时。

在每个实验时间点，用1毫升预冷的PBS洗涤一个孔，然后加入500微升商品化苯酚-氯仿RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液，轻轻振荡裂解细胞。随后，按照试剂盒说明书分离RNA，并在230、260和280纳米波长下通过分光光度法测定RNA的得率和纯度。