吗啉代介导的基因编辑：利用翻译阻断型吗啉代寡核苷酸在单细胞洞穴鱼卵中进行基因敲低的技术 关键词：吗啉代寡核苷酸，基因敲低，翻译阻断，洞穴鱼，单细胞胚胎，基因功能研究，发育生物学

吗啉寡核苷酸是一类短的单链重设计寡核苷酸，其磷酸骨架和糖结构与天然核苷酸不同。这些特性增强了吗啉寡核苷酸在生理pH条件下的稳定性。尽管存在这些差异，吗啉寡核苷酸仍含有标准的碱基，这有助于设计出与目标基因特定mRNA序列互补的寡核苷酸，从而实现对该基因的敲低。

进行吗啉代介导的基因编辑时，首先取放置在琼脂糖注射板孔中的单细胞洞穴鱼卵。观察半透明且呈圆形的鱼卵，定位卵黄囊——即卵内存在的充满液体的结构。

取一支预先装有设计好的吗啉寡聚核苷酸溶液的显微注射针，将溶液直接注射到卵黄中，确保吗啉寡聚核苷酸进入细胞质。在细胞内，目的基因转录生成 mRNA，并被转运至细胞质中。

在细胞质内，注射的吗啉代寡核苷酸与其内源性起始位点处的互补靶标mRNA转录本发生杂交，并延伸至该位点之外。此过程可阻断核糖体大亚基与新生翻译起始复合物的结合，该复合物由小核糖体亚基与某些特定蛋白质结合而成。

随后，翻译起始复合物的进程因空间位阻而受阻，从而抑制了mRNA向蛋白质的翻译。最终，由于吗啉代寡核苷酸的翻译阻断作用，目标蛋白的浓度降低。

在注射当天，使用玻璃移液管将单细胞卵转移到注射板中，每行放置30至40个卵，最多填充五行。用少量鱼类系统水保持卵的湿润。将morpholino置于冰上解冻，并配制注射溶液，使每个卵注射400皮克的morpholino，可使用长型Microloader移液吸头或在末端加入2至4微升的溶液团。

当所有针头装载完毕后，使用镊子修剪注射针尖端多余的长度，并将第一根针安装到与皮升级微注射仪相连的显微操作器上。然后，将注射皿置于解剖显微镜下，利用显微操作器用针头刺入每个卵细胞，并直接向卵黄中注射 1 纳升的吗啉代寡核苷酸注射溶液。