0 次观看 • 5:40 分钟 • July 8th, 2025
从置于显微注射模具孔中的健康单细胞期斑马鱼胚胎开始。
用含有编码 Tol2 转座酶的 mRNA 和转座子供体质粒的溶液填充显微注射针。这些质粒包含一个泛表达的斑马鱼启动子以及两侧带有 Tol2 转座子臂的荧光蛋白编码基因。
将显微注射溶液小心地注入斑马鱼胚胎的细胞质中。在细胞内，Tol2 转座酶 mRNA 翻译生成 Tol2 转座酶蛋白，并主动转运至细胞核内。
供体质粒上的 Tol2 位点包含特定的反向末端重复序列（ITR），这些 ITR 位于报告基因的两侧。ITR 外侧被短的正向重复序列所包围。转座酶蛋白识别并结合 ITR 位点，在侧翼 DNA 上形成发夹结构。转座酶进一步将转座子结构从侧翼 DNA 上切割下来，使其从质粒上释放，同时在原位留下短的正向重复序列。
转座酶在体细胞基因组中产生交错的双链断裂，并将转座子构建体插入基因组位点。随后，DNA聚合酶填补交错末端的缺口，再通过切口连接形成短的正向重复序列。
连接作用导致稳定的转座子结构整合到体细胞基因组中，启动子促进荧光蛋白的表达。培养已注射的胚胎。在胚胎发育过程中，体细胞产生不同类型的细胞，从而生成转基因斑马鱼。
根据文本方案，在制备好 Tol2 转座酶 mRNA 和注射溶液后，于注射前一日下午，设置四到六个繁殖用鱼缸，每缸至少放入两条雄鱼和两条雌鱼。为减少鱼类排泄物并诱导繁殖反应，下午不要喂食。
次日早晨，将制备好的注射溶液从负80摄氏度冰箱中取出，置于冰上。拉开鱼繁殖缸中的隔板，使鱼交配。通常情况下，鱼在20至30分钟内产卵。
等待期间，使用微电极拉制仪并按照以下参数从毛细玻璃管中拉制针头。用实验室擦拭纸折断针头末端，形成斜面边缘。为降低胚胎死亡率，宜采用直径较小的针头。
鱼产卵后，立即将卵收集到直径为10厘米的培养皿中。在解剖显微镜下立即去除所有异常胚胎和鱼的排泄物。然后用移液器将受精胚胎转移至预先准备好的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分，以帮助胚胎固定在原位。
当所有行都填入了可存活的胚胎后，调整其排列，使单细胞相对于注射针水平方向呈45度角。这将使后续的注射操作更加容易。接下来，在佩戴手套的情况下，使用20微升上样移液器吸头从冰上的离心管中吸取5微升已制备好的构建物。
将移液器吸头小心插入断裂的毛细管后端开始变细的位置，使试剂尽可能接近尖端，然后将试剂排入毛细管中。如果仍有气泡，可轻轻晃动针头，注意不要折断尖端。
将针头笔直插入显微注射针头夹持器中，小心拧紧直至针头固定不动，然后将角度调整至约45度。针头准备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。通过调节压力，使用约0.5 PSI进行持针，30 PSI进行注射。
按下踏板时，检查溶液是否能从针头中喷出。使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，将溶液的体积和流速调整至直径约10微米。确保背压使少量溶液从针头滴出。
如果背压不足，毛细作用会导致液体进入针头，从而破坏 mRNA。针头校准后，利用凝胶切口的边缘作为支撑，将针头插入受精胚胎的单个细胞中，该支撑可固定胚胎位置，使针头施加压力时不会移动胚胎。
当针尖进入单个细胞后，踩下脚踏板以释放所需量的溶液。重要的是，必须将溶液注入细胞内，而非卵黄中，以获得转基因斑马鱼。对所有胚胎重复此过程。
操作完成后，使用一次性3.4毫升移液管并配合鱼类系统水，将已注射的胚胎从琼脂糖凹槽中冲洗至标记好的培养皿中。将胚胎置于28.5°C的培养箱中孵育，使其正常发育。