PiggyBac 转座子介导的人类iPSC基因编辑：利用PiggyBac转座子系统在人类iPSC中整合目的基因的实验方案

从悬浮培养的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）开始，将其置于合适的电穿孔缓冲液中。加入含有PiggyBac转座酶编码质粒和供体质粒的溶液。对混合物进行电穿孔处理。

电脉冲可瞬时增加细胞膜的通透性，促进细胞对质粒的摄取。供体质粒包含转座子特异性的反向末端重复序列（ITR），这些ITR互为反向互补序列，并由位于目标蛋白基因和抗生素抗性基因两侧的TTAA重复序列所包围。

表达的PiggyBac转座酶蛋白在ITRs的3'端（位于TTAA重复序列内部）产生切口。暴露的3'-羟基攻击侧翼DNA互补链上的核苷酸，在转座子末端形成TTAA发夹结构，从而将转座子结构从质粒上释放出来。

转座酶将发夹结构解开，在转座子构建体的5'端形成TTAA突出端。转座酶进一步在宿主基因组的TTAA序列处产生双链断裂。释放出的转座子3'-羟基末端攻击交错末端处的TTAA序列，导致转座子构建体与宿主基因组共价连接，并在转座子构建体两侧留下单链缺口。这些宿主DNA上的缺口被连接，从而实现转座子构建体的稳定整合。

将接种在包被有细胞外基质蛋白的培养板上的hiPSCs用含有抗生素的培养基处理。由上游启动子驱动的抗生素抗性基因可用于筛选基因编辑细胞。

用不含钙和镁的 PBS 清洗人 iPSC 培养物，然后在 37 摄氏度下用细胞解离试剂处理 5 至 10 分钟。当细胞开始从培养容器上脱落时，使用 P1000 移液器轻轻手动吹打细胞 3 至 4 次以解离细胞。

将细胞转移至15毫升离心管中，用不含钙和镁的新鲜PBS将终体积调至10毫升，用于细胞计数。通过离心收集1 × 10⁶个细胞，并将沉淀重悬于电穿孔试剂盒中的缓冲液R 100微升中。

加入4.5微克转座载体质粒DNA和0.5微克PiggyBac转座酶质粒DNA进行转染。根据制造商说明书，使用细胞电穿孔系统并按照指定参数进行转染。然后，将细胞接种于添加了10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632的人iPSC培养基中，置于6毫米基质包被培养皿中培养。