农杆菌介导的遗传转化：通过基因工程改造的根癌农杆菌对水稻基因组进行遗传转化的方法

Agrobacterium tumefaciens 是一种植物致病细菌，可通过引入人工构建的 Ti 质粒对其进行遗传改造，该 Ti 质粒在其转移 DNA（即 T-DNA）区域携带目的基因，同时还需提供一个携带毒力（Vir）基因的辅助质粒，以介导 T-DNA 转入植物细胞。

对于 农杆菌介导的遗传转化，从年轻的水稻花序开始，将其切成小片。将切段转移至培养基中培养，以促进切段生长形成一种称为愈伤组织的未分化细胞团。

现在，将愈伤组织转移至含有乙酰丁香酮的农杆菌侵染培养基中——乙酰丁香酮是农杆菌的化学引诱剂。接着，向培养基中加入基因工程改造的农杆菌菌液，并短暂孵育。

乙酰丁香酮分子可激活农杆菌（Agrobacterium）膜上的细胞受体蛋白——VirA，进而介导转录激活蛋白VirG的磷酸化。磷酸化的VirG转移至辅助质粒，启动一系列毒力基因的转录，这些基因包括通道蛋白以及内切核酸酶VirD1和VirD2。

通道蛋白形成连接细菌与植物细胞的转运通道，而内切核酸酶则结合到Ti质粒的边界序列上，并在VirD2（结合于一端）的参与下切割T-DNA。随后，VirD2介导T-DNA通过转运通道进入愈伤组织细胞，并促进其整合到水稻基因组中。

用70%的酒精棉片擦拭每个花序，待其干燥后再进行切割。将花序转移至无菌实验台，用已灭菌的剪刀剪成小段。然后将这些组织片段转移到含有NBD2培养基的培养皿中。

将培养板置于黑暗条件下，26摄氏度孵育10至14天以诱导愈伤组织。进行转化时，从含有选择性抗生素的YEB平板上挑取单菌落，转移至含有相同抗生素的5毫升液体YEB培养基中，培养基于50毫升锥形无菌试管中。将试管置于摇床中，在250 × g、25至28摄氏度条件下振荡培养，直至细菌生长至OD₆₀₀为0.5。

在250毫升锥形瓶中，加入1毫升细菌悬液至100毫升含有相同选择性抗生素的YEB培养基中，于250 × g、28 °C条件下在摇床中振荡培养4小时。在室温下以4,000 × g离心10分钟，收集菌体。弃去上清液，用AAM-AS培养基重悬菌体沉淀，并将悬液稀释至OD₆₀₀为0.4。

孵育结束后，将约150个健康、浅黄色的胚性愈伤组织收集到一个150毫升的无菌烧瓶中。向烧瓶中加入50至75毫升的菌体悬浮液，然后加入10至25毫升新鲜的AAM-AS培养基，浸没愈伤组织10至20分钟，期间偶尔轻轻振荡。

小心地将细菌悬浮液从烧瓶中倒出，用无菌滤纸吸干愈伤组织。然后将其置于含有NBD-AS培养基的培养皿中，并用滤纸覆盖。将愈伤组织在黑暗条件下25至28°C培养三天，期间检查是否存在细菌过度生长。

共培养三天后，使用滤纸将愈伤组织转移到无菌培养皿中，然后在洁净工作台上风干两小时。确保愈伤组织未粘附在滤纸上，随后将其转移至初筛培养基 NBD2 中。

两周后，将愈伤组织均匀转移至含有新鲜筛选培养基的新培养皿中。随后，将愈伤组织转移至新鲜的MS培养基中进行分化，并将芽原基转移至MS培养基（含10 mg/L潮霉素）中以促进更多芽的增殖。