电穿孔介导的 体外 基因递送：一种通过电脉冲技术将编码荧光报告蛋白的质粒导入培养细胞的方法

对于基于电穿孔的质粒DNA转染原代神经元细胞，首先将细胞悬浮于合适的电穿孔缓冲液中。加入编码荧光蛋白的质粒DNA，以制备电穿孔混合液。

轻柔地将电穿孔混合物转移至电穿孔比色皿中，避免产生可能对电穿孔效率产生不利影响的气泡。将比色皿放入电穿孔仪的比色皿架中；设置电穿孔参数。启动电穿孔。

在细胞膜两侧施加的高压短电脉冲会导致膜两侧出现电荷差异性积聚，从而增加跨膜电位，即细胞膜两侧的电压。

当诱导的跨膜电位超过脂质双层的击穿电位时，脂质双层因局部构象改变而失稳，在细胞膜上形成瞬时的亲水性孔道。适当大小的孔道为质粒DNA进入细胞质提供了通路。

电穿孔完成后，脂质双层重新闭合，恢复细胞膜双层的完整性，从而将质粒DNA封闭在细胞内。此外，在细胞周期的某一阶段，当围绕细胞核的双层核膜解体时，质粒DNA会转位至细胞核内。

将电穿孔后的细胞接种到含培养基的多孔板孔中，孔内含有蛋白包被的盖玻片。孵育以使细胞贴附于蛋白包被的盖玻片上。成功转染了质粒DNA的细胞会表达荧光蛋白。

首先，向含有包被盖玻片的24孔培养板的每个孔中加入0.5毫升培养基，并在37摄氏度的二氧化碳培养箱中保温。将所需数量的细胞用移液器加入无菌的1.5毫升微量离心管中，在室温下以200 × g 离心5分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 微升 Opti-MEM 中。重复此步骤两次，以确保管内无残留培养基。按照所列参数设置电穿孔条件。轻轻吹打电穿孔反应液以充分混匀，并使用长型 P200 吸头准确转移 100 微升混合液至 2 毫米间隙的电穿孔杯中。

将比色皿放入比色皿室后，按下电穿孔仪的Ω按钮，并通过精确保持100微升的体积记录阻抗值。阻抗值范围应约为30至35。

按下开始按钮以启动脉冲。记录读数框上显示的测量电流值和珠子数量。从样品室中取出比色皿。

立即将100微升预热的培养基加入比色杯中，并通过上下吹打两到三次重悬细胞。立即把细胞悬液转移至先前准备好的24孔板中。将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育。