激光辅助慢病毒基因递送：一种用于增加小鼠受精卵通透性以促进慢病毒基因递送的技术

激光辅助慢病毒基因递送是一种将转基因导入宿主系统的技术。

为了制备转基因小鼠，首先将分离的小鼠受精卵置于合适的培养基中。将含有受精卵的培养皿放置在已安装激光装置并连接控制软件的显微镜载物台上，选择适当的放大倍数进行观察。

受精卵被透明带包围，透明带是一种保护性的糖蛋白层，可阻挡慢病毒颗粒。为了穿透这一屏障，需打开激光设备，并确保激光LED在透明带上可见。使用控制软件发射激光，根据所需的穿孔直径调整发射持续时间。

将卵放入培养箱中进行复苏。短暂培养后，取出卵并加入携带目的基因和荧光筛选标记的慢病毒颗粒。

透明带穿孔后，慢病毒可轻松扩散至卵细胞膜，并通过内吞作用进入细胞。慢病毒解聚后释放其RNA，该RNA经依次加工形成双链DNA，进入宿主细胞核，将外源基因整合到宿主基因组中。

将受精卵孵育并发育至囊胚阶段。将囊胚植入交配后的雌性小鼠体内。待妊娠完成后，获取仔鼠并检测其转基因的存在情况。

在卵子于培养箱中孵育的同时，根据制造商的建议设置并校准 XYClone 激光系统。当卵子准备就绪后，将第一个液滴培养板放置在激光显微镜载物台上，并手动聚焦透明带。确认激光 LED 光源可通过物镜观察到后，移动显微镜载物台，使 LED 激光对准透明带，并通过计算机软件将 XYClone 激光设置为 250 微秒。

调整LED光源的尺寸至适当大小，然后用激光在每个卵子的透明带打孔三次，形成三个直径为10微米的孔。

进行穿孔操作时必须迅速但小心，因为受精卵在孵化箱外不能停留超过15分钟。

然后，将打孔后的卵子放回培养箱中继续孵育两小时。第二次孵育结束后，在50微升KSOM液滴中加入2微升浓缩慢病毒液，不混匀，再将卵子放回培养箱中继续培养四天。当卵子发育至囊胚阶段时，使用非手术胚胎移植装置，将约10至15枚胚胎连同约2微升KSOM液一并移植入受体。

胚胎移植后17天，让怀孕小鼠自然分娩，或根据需要通过剖宫产收集新生幼鼠。