主动脉血管平滑肌细胞的Von Kossa染色：一种评估动脉中膜层钙化的体外技术

血管平滑肌细胞（VSMCs）是血管壁中层——即中膜层的主要细胞成分。在病理刺激或衰老过程中，这些细胞介导血管钙化——即钙在细胞外基质中沉积的现象。

取一个含贴壁的预先钙化小鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）培养层的多孔板。用甲醛溶液孵育细胞，以交联细胞蛋白并在染色前稳定VSMC结构。

开始进行von Kossa染色时，先从孔中吸除甲醛，然后加入硝酸银溶液。将培养板置于适当的光源下孵育。

当硝酸银溶液到达血管平滑肌细胞层细胞外基质中的钙化位点时，银离子会取代与磷酸盐结合的钙离子，从而产生短暂的黄色着色。在有机物存在和光照条件下，磷酸银发生光化学降解，形成黑色的金属银。

弃去尽可能多的用过的硝酸银溶液。用硫代硫酸钠溶液处理细胞。该溶液可将残留的银盐转化为水溶性复合物，从而将其去除 通过 用清水进行最终漂洗，以提高染色对比度。

对染色后的细胞进行成像，以定位表明钙化的不溶性黑色沉积物。

为诱导血管平滑肌细胞钙化，将细胞接种至六孔培养板中，使其贴壁。随后，用钙化培养基替换原有培养基。于37摄氏度孵育至少七天。之后，吸除细胞培养板中的培养基。用去离子水洗涤细胞一次。

将细胞置于1毫升10%福尔马林中，室温固定20分钟。然后去除福尔马林，并用蒸馏水洗涤固定后的细胞5分钟。

接下来，将细胞置于1毫升5%硝酸银溶液中，在60至100瓦灯泡下孵育1至2小时。随后，吸除硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤5分钟。5分钟后，将细胞放入含1毫升5%硫代硫酸钠溶液的蒸馏水中，孵育5分钟，以去除未反应的银。然后，用蒸馏水再次冲洗细胞5分钟。经von Kossa染色的细胞现已准备好，可使用标准倒置光学显微镜进行成像。