亚甲蓝染色法用于体外评估转移性克隆形成：一种通过定量来自小鼠癌症模型的收获癌细胞来评估转移的染色步骤

在癌症转移过程中，原发性肿瘤的肿瘤细胞通过循环系统迁移，渗出至远端器官，并形成继发性肿瘤。

为了评估已注射4T1细胞的乳腺癌小鼠模型中的肺转移情况（4T1细胞为高转移性乳腺癌细胞），制备含有从收获的肺组织中分离出的4T1细胞的细胞悬液。离心该悬液，并将细胞重悬于含有6-巯基鸟嘌呤（6-TG，一种鸟嘌呤类似物）的培养基中。将细胞悬液接种至培养板中。

6TG进入正常细胞后，由特定的转移酶将其转化为6-TG核苷酸，这是一种有毒的核苷酸。这些细胞毒性核苷酸会掺入DNA中，导致DNA损伤，从而选择性地清除培养物中的细胞。4T1细胞形成毒性核苷酸的能力降低，因此能够存活并贴附于培养板上。根据细胞的增殖能力，它们会形成克隆集落。

用甲醇处理细胞。甲醇可使细胞通透并使细胞内蛋白质变性。随后用亚甲蓝孵育细胞。

带正电荷的染料进入细胞后，与带负电荷的DNA相互作用，嵌入DNA链相邻碱基对之间的空隙中。该染料也可与细胞质中的RNA结合，但亲和力较低。由于细胞核中DNA浓度较高，而细胞质中RNA浓度较低，因此细胞核被染成深蓝色。转移性细胞集落呈现为蓝色小点。

对培养板进行成像。使用软件识别转移性克隆，并量化小鼠肺部的转移负荷。

用1× HBSS将离心管中的体积补至10毫升。然后将液体倒入置于50毫升锥形管上的70微米细胞滤筛中。使用1毫升注射器的推杆轻轻将样品研磨过筛。

在350 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。随后用10毫升1× HBSS洗涤沉淀物两次。将沉淀物重悬于10毫升60 µmol/L 6-巯基嘌呤完全培养基中，并根据需要采用梯度稀释法将样品接种至10厘米细胞培养皿中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育5天。将培养基从培养板中倾倒至适当的废液容器中。为固定细胞，向每块培养板中加入5毫升未稀释的甲醇，并在室温下孵育5分钟，注意轻轻摇晃培养板，使甲醇覆盖整个板面。

将甲醇从培养板倒入适当的废液容器中，然后用 5 毫升蒸馏水冲洗每块培养板。每块板加入 5 毫升 0.03% 的亚甲蓝溶液，在室温下孵育 5 分钟，期间需轻轻摇动亚甲蓝溶液，确保其覆盖整个板面。将亚甲蓝溶液倒入适当的废液容器中，再用 5 毫升蒸馏水冲洗每块板一次。

将培养皿倒置，轻压在纸巾上以吸去多余液体。将培养皿放在其皿盖上，室温下静置过夜晾干。转移性克隆将呈现蓝色。培养皿干燥后，可于室温下长期保存。