结晶紫染色：利用克隆形成实验可视化耐药性癌细胞的技术

在异质性肿瘤细胞群体中，使用抗癌药物治疗会杀死大多数细胞，但耐药细胞会存活下来，从而导致治疗失败。

为了确定耐药细胞的比例，将异质性肿瘤细胞群体接种于多孔板中。孵育以促进细胞贴壁。加入浓度递增的合适抗癌药物溶液。

药物分子与敏感细胞相互作用会导致细胞死亡，随后从培养板上脱落。相比之下，耐药细胞则存活并仍附着在培养板上。

吸弃旧培养基以去除脱落的细胞。加入新鲜的无药物培养基，在生理条件下孵育培养板。耐药细胞将增殖并形成肿瘤克隆。随后向克隆中加入结晶紫染色液，孵育。

结晶紫是一种呈紫色、可穿透细胞膜且带正电荷的染料，能够进入细胞并结合阴离子蛋白和DNA，从而使细胞呈现紫色。

接着加入乙醇以溶解未反应的染料。洗涤以去除多余的染料，并将平板晾干。

耐药菌落呈紫色斑点。计数每个孔中着色菌落的数量。通过图表表示细胞存活率的百分比，以确定在每种药物浓度下耐药癌细胞的比例。

在此步骤中，使用6孔板，每孔加入2毫升培养基，接种2000个细胞。24小时后，对DU145和22Rv1细胞系分别加入浓度递增的多西他赛。另设一孔仅加入DMSO作为对照，其体积与最高浓度多西他赛处理组所用体积相同。

72 小时后，吸除含药物的培养基，加入新鲜的不含多西他赛的培养基。将培养板孵育一至两周，直至在显微镜下可见克隆集落。

为染色菌落，先用 2 至 3 毫升 PBS 轻轻冲洗，然后在组织培养罩或通风橱内加入 2 至 3 毫升结晶紫溶液，孵育 20 分钟。随后，移除染色液，并用 2 至 3 毫升水洗涤培养板。接着，吸去水分，将培养板晾干。

拍摄平板的数字图像以用于图示。通过观察各孔并借助记号笔手动计数菌落来分析结果。