茜素红染色：一种用于可视化培养成骨细胞矿化作用的技术

成骨细胞是形成骨骼的细胞，可将其分泌的小囊泡释放到细胞外基质（ECM）中。这些囊泡称为基质小泡，其表面含有膜转运蛋白和酶，可促进钙离子和磷酸根离子进入囊泡内部，进而在其中形成矿物质晶体。随着晶体不断积累，最终突破囊泡膜，在细胞外基质中形成矿化结节，构成骨矿物质密度。

为了观察矿化过程，首先将成骨细胞置于生物相容性支架上，并加入适宜的生长培养基。成骨细胞会附着在支架上，并利用培养基中的生长因子分泌基质小泡，这些小泡随后在细胞外基质（ECM）中形成矿化结节。

吸除培养基，并冲洗细胞以去除残留的培养基。用甲醛溶液处理细胞，该处理可诱导细胞外基质交联，固定并保存组织结构。洗涤细胞以去除残留的甲醛。

接着，加入茜素红染色液并孵育培养物。染料分子会与矿化结节结合，并与钙（一种关键的骨矿物质）相互作用，形成较大的染色复合物。

吸除染色液并充分洗涤，以去除未结合的染料。在显微镜下观察，富含钙的矿物质沉积物在细胞外基质中呈现为鲜红色结节，表明成骨细胞已发生矿化。

在添加成骨矿化培养基14天后，吸除原代成骨细胞的培养基。用0.5毫升1×PBS冲洗两次。然后加入0.5毫升10%缓冲福尔马林溶液固定细胞，在室温下孵育10分钟。10分钟后，使用一次性移液器吸除10%缓冲福尔马林溶液，并用0.5毫升超纯水洗涤两次。随后，向固定的成骨细胞中加入250微升40毫摩尔的茜素红S染色液，在室温下将培养板置于摇床上以每分钟100次振荡孵育10分钟。

加入染色液孵育后，使用一次性移液器吸除染色液，并用1毫升超纯水冲洗。重复此步骤5至10次，直至洗液澄清，以去除非特异性染色。最后一次洗涤液吸除后，加入1毫升冷的PBS缓冲液，在摇床上室温孵育10分钟，操作同前。接着，将染色后的β-磷酸三钙圆片转移至新的孔中，使用平板扫描仪扫描各孔，以记录矿化情况。