吉姆萨染色法用于克隆形成实验：一种体外评估间充质干细胞增殖能力的染色方法

集落形成实验用于检测细胞增殖并形成集落的能力。

首先，将含有红细胞和单个核细胞（包括间充质干细胞或MSCs）的骨髓来源细胞悬液接种于培养板中的培养基内，并进行孵育。间充质干细胞会贴附于培养板底部，而红细胞和单个核细胞则保留在悬液中，随后被弃去。

加入含有生长因子的新鲜培养基以支持间充质干细胞（MSC）的存活。根据各自不同的增殖潜能，间充质干细胞会增殖并形成集落。

接下来，用甲醇处理菌落。甲醇可使细胞通透化，置换细胞内环境中的水，并使蛋白质变性，从而保存细胞结构。

将固定的菌落与吉姆萨染色液孵育——该染色液是亚甲蓝氧化产物的混合物，主要成分为碱性染料天青B和酸性染料伊红Y。当天青B扩散进入细胞后，其带正电荷的二聚体通过嵌入方式与细胞核中带负电荷的DNA结合，从而产生蓝色染色。

带负电荷的伊红Y单体随后与结合的亚甲蓝B二聚体上未被中和的正电荷相互作用，形成“伊红Y-亚甲蓝B复合物”，使染成蓝色的DNA颜色变为紫色。

在核糖体丰富的细胞质中，亚甲蓝B与带负电荷的RNA结合，但由于伊红Y难以穿透高度密集的核糖体，从而阻止了伊红Y-亚甲蓝B复合物的形成，使RNA染成蓝色。

现在，用缓冲液洗涤平板以去除多余的染料，并在空气中干燥。计数菌落数量，菌落表现为细胞簇，细胞核呈紫色，细胞质呈蓝色。

为进行集落形成单位（CFU）实验，每皿使用无菌水将储备液按1:10稀释，制备10毫升吉姆萨溶液。移除细胞培养皿中的培养基，并用PBS小心洗涤细胞。

用纯甲醇在室温下固定细胞 5 分钟，然后弃去甲醇并加入吉姆萨染液。在 37 摄氏度的湿化孵育箱中孵育 60 分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞两次。随后，将培养板正面朝上置于纸巾上自然风干。用记号笔在培养板背面手动计数克隆集落。