双重染色法：利用钌红与乳酚棉蓝染色技术可视化植物-真菌互作

在咖啡锈病中，病原真菌Hemileia vastatrix的孢子落在植物表面，并长出芽管，从而通过菌丝启动感染。

菌丝在组织内扩散并侵入植物细胞 通过 称为吸器的特化指状结构，可吸收植物养分。吸器还能分泌效应子分子，这些分子被植物的抗性蛋白识别，从而引发富含果胶的包裹结构形成，以限制病原侵染。

为了观察这种相互作用，首先准备一片超薄的、树脂包埋的受感染咖啡叶片切片。随后，用乳酚棉蓝对样品进行处理——这是一种由苯酚、乳酸、甘油和棉蓝组成的组织学染色剂。短暂加热载玻片。

当染料成分渗入组织时，苯酚可杀灭所有活体生物，而乳酸和甘油则有助于保持细胞结构的完整性。同时，棉蓝分子会与真菌细胞壁中的几丁质部分结合，使其染成蓝色。

用蒸馏水洗涤样品，然后用钌红染料处理样品。

带正电荷的钌分子会与富含果胶的植物细胞壁中带负电荷的多糖结合，并将其染成红色。再次洗涤载玻片，并在显微镜下观察。

富含果胶的植物细胞壁呈红色，包裹着从蓝色菌丝延伸出的蓝色吸器。

使用配备8厘米钢制刀片的旋转式切片机将组织块切成5微米厚的切片。将切片置于覆盖有蒸馏水的载玻片上，然后将载玻片转移至40摄氏度的加热板上烘干，以促进切片与载玻片的黏附。

干燥后，用组织块编号和切片编号标记玻片。在切片上覆盖2毫升乳酸酚棉蓝染液（5%），置于45摄氏度的加热板上加热5分钟。

用盛有蒸馏水的烧杯洗涤载玻片三次，以去除多余的染料。随后用 2 毫升水中含 0.01% 钌红的溶液染色一分钟。

用蒸馏水清洗载玻片三次以去除多余的染料。在切片上滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，用于进行光学显微镜分析。