阳离子交换层析:一种基于净表面电荷从昆虫细胞裂解物中分离靶重组蛋白的技术

0 次观看3:33 分钟 • July 8th, 2025

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阳离子交换色谱法有助于根据混合物的净表面电荷从混合物中分离蛋白质。

对于从昆虫细胞蛋白裂解物中分离靶信号转能器蛋白,获得含有其他污染蛋白的透析靶蛋白裂解物。添加含氯化钠的缓冲液,降低裂解物粘度,提高蛋白质溶解度,有助于防止运行过程中色谱柱堵塞。

此外,缓冲液 pH 值低于靶蛋白的等电点 pI,该点蛋白质的净电荷为零,有助于多余的氢离子与负羧酸基团结合,使靶蛋白带正电荷。

组装含有与带负电荷的基团偶联的交联琼脂糖珠的色谱柱。添加结合缓冲液以平衡色谱柱并最大限度地提高色谱柱-蛋白质相互作用。将稀释的裂解物加载到平衡的色谱柱上。

与带正电荷

较少的污染蛋白相比,带正电荷较少的靶蛋白与色谱柱的负电荷基团相互作用并紧密结合。

用缓冲液洗涤色谱柱以去除未结合的带负电荷的污染蛋白。随后,通过洗脱缓冲液,同时逐渐增加其离子强度。

在低离子强度下,正离子和蛋白质之间对色谱柱中负基团的竞争最小,洗脱了弱结合、带正电荷较低的污染蛋白。然而,随着离子强度的增加,盐离子与紧密结合的靶信号换能器蛋白竞争,减少蛋白质与色谱柱之间的相互作用,将它们作为纯化馏分洗脱。

备 20 毫升阳离子交换柱,方法是用三柱体积的缓冲液 G,然后用三柱体积的缓冲液 F 洗涤它。接下来,通过加入 20 毫升缓冲液 E,将 20 毫升透析样品稀释至最终氯化钠浓度为 100 毫摩尔,并将样品施加到交换柱中。

释少量样品而不是一次性稀释所有样品至关重要,稀释后的样品应在稀释后立即施加到色谱柱中,以限制蛋白质的沉淀。

当之前的稀释液接近上样结束时,继续用新鲜稀释的样品加载色谱柱。然后,用缓冲液 F 将色谱柱洗涤至基线吸光度 280,这通常需要三个色谱柱体积。

从缓冲液 F 到 65% 缓冲液 G,以 400 毫升梯度从色谱柱中洗脱蛋白质,以 6 毫升馏分收集洗脱液。梯度完成后,继续洗涤色谱柱,再洗涤 1.5 个柱体积的 65% 缓冲液 G。

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最后更新:1 八月 2026