为什么零假设检验对聚糖分离验证很重要？

零假设检验可确保聚糖保留时间或峰强度的观测差异具有统计学显著性，从而支持对靶标的可靠验证，并减少聚糖分析中的假阳性结果。

独立变量隔离如何适用于HILIC糖链分析？

分离流动相组成和流速等变量，可使研究团队将糖链分离的变化直接归因于实验条件，从而加强发现阶段的方法优化与可重复性。

定量因变量测量在HILIC工作流程中能够实现什么？

荧光强度和保留时间的定量测量能够实现对糖类物质的精确比较，有助于稳健的检测方法开发，并支持基于数据的进展决策。

为何复制要求对于跨功能聚糖分析至关重要？

重复性可确保在不同实验和团队之间进行聚糖分离与检测时结果的一致性，从而在生物制剂开发中实现可靠的数据共享和跨职能协作。

实施HILIC之前需要具备哪些统计分析能力？

团队必须应用统计工具评估色谱图的重现性、峰分辨率和信噪比，在将HILIC整合到更广泛的R&D工作流程之前，确保分析方法的稳健性。

亲水相互作用液相色谱：一种利用亲水性微珠分离亲水极性分析物的技术

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学技术

0 次观看 • 3:07 分钟 • July 8th, 2025

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亲水相互作用液相色谱（HILIC）是一种根据极性化合物极性强弱对其进行分离的技术。首先，安装一根填充有携带极性官能团的亲水性微珠的HILIC色谱柱。

首先，使用平衡缓冲液和流动相（有机溶剂与水的混合物）对色谱柱进行预处理。缓冲液分子可稳定 pH，而有机溶剂则使色谱柱达到饱和。水分子固定并在亲水性微珠表面形成一层水化层。

加载含有荧光标记的糖链混合物（亲水性极性化合物）的样品。使用流动相梯度，以最佳流速通过色谱柱运行样品。

当样品在疏水性流动相中移动时，糖链会迁移至水相层，而杂质则被留在后面。随后，糖链向微珠上的极性官能团移动。在此过程中，极性较强的糖链结合牢固，而极性较弱的糖链结合较松散。

随着流动相疏水性的降低，极性较小且保留时间较短的弱结合糖链首先洗脱。相反，极性较高且保留时间较长的强结合糖链最后洗脱。

最后，检测器检测洗脱组分的荧光信号，该信号对应于色谱图中的标准糖链峰。

首先，打开控制流动相的软件。以0.2毫升/分钟的流速，用50%溶剂B和50%溶剂C冲洗UPLC仪器，持续30分钟。然后，以0.2毫升/分钟的流速，用25%溶剂A和75%溶剂B冲洗20分钟，随后将流速调整至0.4毫升/分钟继续冲洗。

将标记的 N-聚糖溶解于25微升体积比为2:1的100%乙腈与超纯水混合液中。随后，在4摄氏度下以134 × g 离心5分钟，并使用进样管将10微升上清液注入UPLC仪器中。

以每分钟0.4毫升的流速分离标记的N-聚糖，在25分钟内采用75%至62%乙腈的线性梯度。随后，在60摄氏度条件下，使用UPLC对葡聚糖校准梯度/糖肽柱进行分析运行。

在激发波长 330 纳米和发射波长 420 纳米的条件下检测 N-聚糖荧光。