基于尺寸排阻色谱的细菌细胞外囊泡分离:一种根据大小分离革兰氏阴性细菌外膜囊泡异质群体的技术

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在合适的培养条件下,革兰氏阴性菌将载货外膜囊泡(OMV)释放到上清液中。这些囊泡是大小不一、小的球形结构,介导细胞通讯。

要分离不同大小的OMV亚群,请取一个空的尺寸排阻色谱柱,其底部有一个适当的过滤器来支撑基质。

用凝

胶过滤基质填充色谱柱,该基质由具有规定孔径的化学惰性球形珠组成,确保尺寸最佳,以排除大尺寸 OMV 进入。用适当的缓冲液平衡色谱柱,以防止磁珠干燥,以获得最佳纯化效果。

将含有不同大小的OMV、蛋白质聚集体和核酸亚群的细菌培养上清液加载到色谱柱顶部。让样品在重力的作用下运行。

当样品通过色谱柱时,无法进入孔隙的较大OMV会穿过凝胶珠之间的颗粒间空间,首先被洗脱。同时,较小的OMV穿透基质孔,走更长的路径,然后洗脱。

由于体积较小,蛋白质聚集体和核酸进入基质中的各种孔隙,导致它们在色谱柱中的保留时间最长,并作为最后馏分洗脱。收集单独的 OMV 洗脱液并储存起来以供进一步分析。

首先,使用玻璃棒混合一瓶凝胶过滤介质,并将填充色谱柱所需的体积加上大约 50% 的过量倒入玻璃瓶中。让珠子沉淀下来,然后倒出多余的液体。将珠子重悬于洗脱缓冲液中,至约70%凝胶和30%缓冲液的最终溶液中,并在真空下对溶液进行脱气。

色谱柱安装在垂直位置的环形支架上,并在色谱柱中填充洗脱缓冲液以润湿壁,然后排出缓冲液,直到只剩下约 1 厘米。然后,小心地将凝胶珠移液到色谱柱中,同时排出多余的缓冲液以防止珠子沉降,直到色谱柱填充到色谱柱储液器底部下方约2厘米的高度。

加载样品之前,在真空下对洗脱缓冲液进行脱气。用大约两倍于色谱柱体积洗脱缓冲液洗涤色谱柱。一旦缓冲液到达凝胶层顶部,小心地在凝胶层顶部添加 2 毫升每升 100 至 200 纳摩尔的外膜囊泡样品,不要干扰表面,让样品进入凝胶。

慢慢地,在不干扰凝胶层的情况下将洗脱缓冲液添加到色谱柱中,并在色谱柱下方放置一个 50 毫升的试管。为防止色谱柱干燥,同时在色谱柱顶部添加洗脱缓冲液。

收集 20 毫升洗脱液后,在色谱柱下方放置一架 1.5 毫升试管。在每个试管中总共收集 96 个 1 毫升馏分。在收集样品的同时,不断向色谱柱中添加洗脱缓冲液。要清洁色谱柱,请将 1 个柱体积的 0.1 摩尔氢氧化钠通过色谱柱,然后运行 2 个柱体积的洗脱缓冲液。

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Last updated: 4 July 2026