Name: RNA含外来体的分离和鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学习从细胞培养基和生物体液中分离外泌体的方法，通过超速离心、电子显微镜和流式细胞术进行纯化与鉴定。该技术有助于深入研究外泌体在细胞间通讯中的生物学功能及其潜在临床应用价值。

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本研究由瑞典研究理事会（K2008-57X-20 676-01-3）资助。

1. 外泌体分离
<ol>
	<li>使用无外泌体血清的培养基培养细胞。因此，添加至细胞培养基中的任何血清均须在使用前于 4 °C 下以 120 000 × g 超速离心过夜，以去除外泌体。</li>
	<li>将细胞悬液转移至锥形管中。</li>
	<li>于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至超速离心管中，若体积不足则加入 PBS 补充。</li>
	<li>于 4 °C 下以 16 500 × g 离心 20 分钟，进一步去除细胞及细胞碎片。</li>
	<li>通过 0.2 μm 滤膜过滤上清液，以去除大于 200 nm 的颗粒。</li>
	<li>将过滤后的上清液转移至新的超速离心管中，密封管口，随后于 4 °C 下以 120 000 × g 超速离心 70 分钟，使外泌体沉淀。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>为最大程度回收外泌体，需反复用少量适当缓冲液（约 3 × 50 μL）重悬富含外泌体的沉淀。所用缓冲液取决于外泌体分离后的下游实验。例如，裂解缓冲液用于蛋白质和 RNA 提取，PBS 用于电子显微镜和流式细胞术，功能研究则可能更适用培养基。</li>
</ol>
注意：外泌体也可使用与细胞培养基相同的方法从不同的体液（如血浆）中分离。对于黏稠的液体，可能需要在离心和过滤步骤前用PBS稀释样品。关于上述第5步的离心速度，可提高至29 500 × g，第7步的超速离心时间可延长至90分钟18。
如果需要对样本进行进一步纯化，可将外泌体沉淀物在蔗糖梯度中进行漂浮，外泌体主要存在于密度为1.13–1.19 g/ml的组分中2。
2. 通过电子显微镜鉴定外泌体
<ol>
	<li>为进一步去除污染蛋白，将富含外泌体的沉淀重悬于 PBS 中，并在 4 °C 下以 120 000 × g 超速离心 70 分钟，使外泌体再次沉淀。</li>
	<li>取少量样品用于蛋白提取及总蛋白浓度测定。确保仅裂解样品的一小部分用于蛋白定量，同时将完整外泌体（溶于 PBS 中）另置，置于冰上或 -80 °C 保存，以备后续实验使用。</li>
	<li>在 Parafilm 上滴加一滴样品（约含 10 μg 外泌体蛋白的 PBS 重悬外泌体），然后用镊子将覆有 Formvar 碳膜的镍网轻轻置于液滴上，孵育 30–60 分钟。注意将镍网有涂层的一面朝下，与含外泌体的液滴接触。</li>
	<li>在 Parafilm 上放置三滴 PBS，每滴 30 μl，通过将镍网依次置于 PBS 液滴上进行清洗，并在各步之间使用吸水纸吸去多余液体。使用吸水纸时应轻柔，仅靠近镍网边缘，避免接触涂层区域。</li>
	<li>在 Parafilm 上滴加一滴 2% 多聚甲醛，将镍网置于液滴上固定样品 10 分钟。</li>
	<li>在进行免疫染色前，重复第 4 步的清洗操作。常用的抗体包括抗 CD63 和抗 MHC II 类分子抗体。也可不进行免疫染色而直接进行透射电镜观察，因外泌体可根据其大小和形态被识别。然而，我们建议同时评估其大小、形态以及膜蛋白的存在，以获得更可靠的鉴定结果。</li>
	<li>将镍网转移至 30 μl 的一抗溶液液滴上，孵育 40 分钟。清洗时重复第 4 步操作，但使用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 代替纯 PBS。</li>
	<li>重复第 7 步操作，但使用 10 nm 金标二抗，并以 PBS 单独清洗。</li>
	<li>在 Parafilm 上滴加一滴 2.5% 戊二醛进行后固定，将镍网置于液滴上孵育 10 分钟。重复第 4 步的清洗操作，但使用五个去离子水液滴代替三个 PBS 液滴。</li>
	<li>在 Parafilm 上滴加一滴 2% 醋酸铀进行染色，将镍网置于液滴上孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 Parafilm 上滴加一滴含 0.13% 甲基纤维素和 0.4% 醋酸铀的溶液，将镍网置于液滴上孵育 10 分钟，以实现样品包埋。</li>
	<li>用吸水纸轻轻吸去多余液体，然后将镍网（涂层面向上）置于滤纸上，室温晾干 5 分钟。</li>
	<li>使用透射电镜观察样品，或将镍网存放在网格盒中以备后续使用。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术表征外泌体
由于外泌体体积过小，无法被当前的流式细胞仪设备直接检测，因此必须首先将外泌体与抗体包被的微珠结合（图1）。这些微珠可直接购买现成产品，也可在实验室中使用选定的抗体自行制备。根据外泌体的细胞来源不同，可将不同的抗体偶联至微珠，微珠可为磁性或乳胶材质。目前我们在此分析中使用抗MHC II类分子抗体或抗CD63抗体包被的微珠。
<ol>
	<li>对于使用“自制”抗体包被的微珠，我们采用4 μm的乳胶微珠并包被抗CD63抗体。将25 μl 4 μm乳胶微珠（30 × 106 个微珠）用100 μl MES缓冲液洗涤两次，3 000 × g离心15–20分钟，将沉淀重悬于100 μl MES缓冲液中。配制抗体混合液，其中含12.5 μg抗体，并加入等体积的MES缓冲液。将微珠加入抗体混合液中，在室温下振荡孵育过夜。用PBS将抗体包被的微珠洗涤三次（3 000 × g，每次20分钟），并将沉淀溶解于100 μl储存缓冲液中（最终浓度为300 000 个微珠/μl）。</li>
	<li>对于每个样品（每种抗体），继续操作时所用体积应至少含有30 μg外泌体蛋白（溶于PBS中的完整外泌体），对应约100 000个抗体包被的微珠。</li>
	<li>将外泌体与微珠在300 μl PBS总反应体系中混合，于4 °C轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>加入300 μl 200 mM甘氨酸进行封闭，孵育30分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（含1–3%血清的PBS）将外泌体-微珠复合物洗涤两次，600 × g离心10分钟。</li>
	<li>将外泌体-微珠复合物与50 μl IgG抗体在4 °C孵育。随后按照步骤5所述方法，用洗涤缓冲液将复合物洗涤两次。</li>
	<li>向外泌体-微珠复合物中加入90 μl洗涤缓冲液和10 μl目标抗体（推荐使用抗CD9、抗CD63或抗CD81抗体），在轻柔振荡条件下孵育40分钟。再按照步骤5所述方法，用洗涤缓冲液将复合物洗涤两次。</li>
	<li>加入300 μl洗涤缓冲液，使用流式细胞术采集数据。</li>
</ol>
如上所述，可使用不同的珠粒，例如本方案中所述的乳胶珠粒或磁珠。如果使用磁珠，则需注意，该方案略有不同：封闭步骤（第4步）无需进行，洗涤步骤则通过将离心管置于磁力架上而非离心来完成。
用于“自制”抗体包被磁珠的储存缓冲液含有 0.1% 甘氨酸和 0.1% 叠氮化钠的 PBS，pH 为 7.2。
重要的是，务必在流式细胞术洗涤缓冲液（PBS 中含 1-3% 血清）中使用去除外泌体的血清，以避免血清中外泌体污染分析结果。
注意：使用抗体偶联微珠进行外泌体表征时，必须认识到仅能分离和表征特定抗体所针对的特定亚群。
4. 通过蛋白质印迹法检测外泌体
Western blot 是一种成熟的方法，本文将不再详述该方法本身，而是重点介绍 Western blot 前合适的蛋白质提取方法以及所使用的不同抗体的重要性。
<ol>
	<li>将外泌体沉淀溶解于所选的蛋白裂解缓冲液中，充分吹打混匀，随后涡旋混合。为进一步裂解外泌体，将样品在水浴超声仪中处理3次，每次5分钟，两次之间进行涡旋混合。最后将样品以13 000 × g在室温下离心5分钟，并将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>采用所选方法测定总蛋白浓度，并按每孔20–50 μg的蛋白量上样。</li>
	<li>通过凝胶电泳分离蛋白，并用电转印法将蛋白转移至膜上。</li>
	<li>在对外泌体中富集的蛋白进行免疫染色前，对膜进行封闭和洗涤。</li>
	<li>使用化学发光法、数字成像系统及分析软件检测目标蛋白。</li>
</ol>
由于目前尚无外泌体特异性标志物，通常使用在所有不同细胞来源的外泌体中富集的蛋白质来检测外泌体。这些蛋白质包括四跨膜蛋白家族（如 CD9、CD63 和 CD81）、细胞骨架相关蛋白（如 ezrin）以及参与多泡体生成的蛋白（如 Tsg101 和 alix）。此外，外泌体中还常检测到 Flotillin、Hsc70 和多种 Rab 蛋白等。然而，外泌体中也存在特定细胞来源的蛋白，例如 A33（肠上皮细胞）、CD3（T 细胞）和 MHC II 类分子（抗原呈递细胞）。因此，外泌体的检测标志物会因其释放的细胞类型不同而有所差异。
由于细胞的其他区室也能产生囊泡，因此进一步建议检测这些区室的蛋白质是否存在，例如内质网（如calnexin和Grp78）和高尔基体（如GM130）的标志蛋白。因此，若这些蛋白质缺失，则表明所研究样本中基本不存在或仅有少量来自其他区室的囊泡污染。
5. 外泌体RNA的分离与RNA分析
<ol>
	<li>将外泌体沉淀溶解于所选的RNA裂解缓冲液中，并进行RNA提取。根据下游实验的不同，可使用不同的RNA分离试剂盒，但基于柱的方法可获得RNA种类更广泛的样本。目前我们使用Exiqon公司的miRCURY RNA分离试剂盒，但其他试剂盒也可能适用于特定的科学问题。</li>
	<li>进行RNA分离时，必须在无RNase的环境中操作。因此应使用核酸和核酸酶-free的移液器吸头，并对实验台面和设备进行擦拭，以去除污染物和RNase。</li>
	<li>使用miRCURY RNA分离试剂盒进行RNA提取时，将外泌体沉淀溶解于350 μl裂解液中，涡旋混合15秒。</li>
	<li>加入200 μl 95%乙醇，涡旋混合10秒。</li>
	<li>将一个离心柱放入收集管中，将裂解后的外泌体转移至离心柱内，于14 000 x g离心1分钟。</li>
	<li>向含有外泌体RNA的离心柱中加入400 μl洗涤液，洗涤三次，每次于14 000 x g离心1分钟。</li>
	<li>将离心柱于14 000 x g离心2分钟，确保柱体干燥，然后将干燥的离心柱转移至无RNase的EP管中。</li>
	<li>向离心柱中加入50 μl洗脱缓冲液，先于200 x g离心2分钟，再于14 000 x g离心1分钟。</li>
	<li>继续使用所提取的RNA，或将RNA储存于-80 °C。</li>
</ol>
为了检测和分析提取的总外泌体RNA，使用配备RNA 6000 Nano或RNA 6000 Pico试剂盒的Agilent 2100生物分析仪。该分析可显示外泌体RNA的产量及片段大小分布情况。
6. 代表性结果
外泌体体积过小，无法通过现有的流式细胞术方法直接检测，因此在分析前需将其结合到抗体包被的微球上（图1）。由于外泌体-微球复合物可能发生聚集，流式细胞术散点图中可能包含单个、双联和三联微球的不同群体（图2A）。箭头指示的是进一步分析的单个微球群体。图中显示了与同型对照相比，CD63阳性的单个微球-外泌体群体（图2B）。
由于外泌体体积较小，只能通过电子显微镜直接观察，而无法通过光学显微镜观察。外泌体典型的形态学特征为圆形、大小在30-100 nm之间的膜性囊泡。图3中的电子显微镜照片显示了经免疫染色的外泌体（A），其中使用金标抗体针对CD63进行标记（箭头所示），以及未经免疫染色的外泌体（B）。
为了确认分离得到的囊泡确实是外泌体，并进一步表征外泌体蛋白，通常使用蛋白质印迹（Western blot）。图4显示钙网蛋白（calnexin）——一种内质网标志物——未被检出，表明囊泡中几乎无内质网来源的污染。此外，图4显示外泌体中存在CD81，这是一种常在外泌体中富集的四跨膜蛋白（tetraspanin）。
细胞RNA主要包含核糖体RNA（rRNA），在Bioanalyzer分析中表现为18S和28S rRNA亚基的两个显著峰（图5A）。然而，外泌体RNA的谱型与此不同，由于外泌体缺乏18S和28S这两个rRNA峰，因而富含mRNA和miRNA等短链RNA（图5B）。
<img alt="通过流式细胞术检测外泌体的CD63或MHC II磁珠示意图，显示四跨膜蛋白的相互作用。" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1。由于外泌体体积较小（30–100 nm），在进行流式细胞术分析时无法与噪声和背景信号区分。因此，在分析外泌体之前，必须将其结合到抗体包被的磁珠上，从而可通过激光进行检测和可视化。
<img alt="流式细胞术分析示意图，显示细胞事件测量的散点图（A）和直方图（B）" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 外泌体-磁珠复合物可相互聚集，形成双联和三联磁珠（A）。箭头所示为单个磁珠-外泌体群体，该群体系经门控后用于后续分析。该群体将直接与同型对照（灰色填充峰）进行比较，以确定外泌体膜分子的存在。CD63阳性外泌体（黑色空心峰）如图B所示。
<img alt="纳米颗粒的透射电子显微镜图像，显示颗粒形态和尺寸比例尺。" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 外泌体的电子显微图像，显示典型的形态和大小（40–80 nm）（A 和 B）。图 A 中的箭头指示二抗的金颗粒，证实该外泌体在其膜表面表达CD63蛋白。
<img alt="Western blot、蛋白质分析、钙连蛋白、CD81、细胞与外泌体对比、分子量标记" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4。Western blot 结果显示，内质网蛋白钙连蛋白（calnexin）不存在，而外泌体中常见的四次跨膜蛋白 CD81 存在。
<img alt="色谱分析结果；蛋白质分析的双峰图（A）和宽谱分析（B）" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. Bioanalyzer 检测结果显示细胞（A）和外泌体（B）中存在 RNA。箭头指示细胞中存在的 18S 和 28S rRNA 亚基。由于外泌体 RNA 主要包含小分子 RNA，因此在外泌体中未检测到或仅检测到极少量 rRNA。

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</ol>

JL 是一项专利的共同持有人，该专利涉及将外泌体用作将 RNA 转移至细胞的载体。

在研究外泌体的分子成分和/或功能时，使用一种高质量的分离方法至关重要，该方法应能提供适当的得率，并将污染程度降至最低。本文所述的方法是一种已确立的外泌体分离技术，可用于研究其RNA含量及生物学功能。此外，本文还强调了通过多种方法（包括电子显微镜、流式细胞术和蛋白质印迹）联合对外泌体进行表征的重要性。
在分离外泌体时，第一次离心步骤（300 × g）用于沉淀细胞悬液或待研究的生物液体中可能存在的细胞。第二次离心在16 500 × g下进行，其离心力必须足够强，以沉淀死细胞、较大的碎片、凋亡小体及其他细胞器。此步离心后，部分实验方案包含纳米过滤步骤，但也有研究者省略了该步骤。然而，我们强调必须清除大于200 nm的碎片和囊泡，因此强烈建议包含过滤步骤。若需要更严格的分离，可使用100 nm滤膜，但需注意，若处理黏稠液体，这些滤膜容易堵塞，导致外泌体材料丢失。此外，100 nm过滤可能影响外泌体的形态，且若外泌体尺寸偏大，则可能被截留而丢失。因此，200 nm滤膜在分离外泌体时显得更为合适。过滤后，必须进行120,000 × g的超速离心，以沉淀外泌体。外泌体可进一步用PBS洗涤，或与抗体包被的磁珠结合后洗涤，也可通过蔗糖梯度离心去除污染蛋白。然而，这一过程可能消耗大量资源，我们认为在起始样品体积较小和/或外泌体RNA含量较低的情况下并非必要，因为额外步骤会显著减少样本量。但再次强调，所分离囊泡的性质应通过特定蛋白的存在与否加以验证。
迄今为止，尚未发现能够绝对特异性地标记外泌体的蛋白质，以确证样本中仅含有外泌体而无其他成分。因此，需要结合多种方法对外泌体进行表征，其中包括通过电子显微镜检测外泌体的大小和形态。此外，电子显微镜还可用于评估样本的纯度，因为该方法能够提供样本污染程度的整体信息，例如是否存在较大的囊泡（如微粒、凋亡小体或细胞碎片）。同时，可通过流式细胞术和蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体的蛋白质组成，结合这两种方法可实现对外泌体膜结合蛋白（如CD63和CD81）及内化蛋白（如Tsg101和alix）的全面分析。若检测到外泌体中富集的蛋白质（如CD63、Tsg101和alix），同时未检测到内质网蛋白calnexin等非外泌体来源蛋白，则表明所获得的外泌体富集沉淀物确实为外泌体，而非来自细胞其他区室的污染囊泡。
在外泌体中检测到的RNA谱与完整细胞中的RNA谱存在根本性差异。因此，通过生物分析仪或基于凝胶的RNA分析方法检测外泌体RNA时，不会出现细胞RNA分析中明显的18S和28S rRNA亚基的两个峰。因此我们认为，若在样本中检测到较大量的rRNA，则表明所提取的总RNA并非完全来源于外泌体，提示分离方法需要改进并进行质量验证。

<table><tbody><tr><td>Optima L-90K 超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>65670</td><td></td></tr><tr><td>Quick-seal 超速离心管</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td>根据所使用的转子不同，需要使用不同的离心管。Ti70（342414），Ti45（345776）</td></tr><tr><td>Quick-Seal 无线管帽套装</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur 注射器滤器，0.20&amp;mu;m </td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1826.001</td><td>对于粘稠液体和/或大体积样品，可改用 VWR International 的真空过滤系统，0.2 &amp;#x03BC;m（514-0600）。</td></tr><tr><td>Formvar/碳涂层镍网</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1GN200</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD63 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>终浓度：0.05&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>同型对照；IgG1&amp;#954;（MOPC 21）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9269</td><td>终浓度：0.05&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>10 nm 金标抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7777</td><td>终浓度：1%</td></tr><tr><td>LEO 912AB Omega 电子显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>或性能相当的设备。</td></tr><tr><td>4&amp;mu;m 醛基/硫酸酯化乳胶微球</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>12-4000</td><td></td></tr><tr><td>用于乳胶微球包被的抗体</td><td></td><td></td><td>例如 BD Bioscience 的抗 CD63 抗体（556019）</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L 混匀仪</td><td>ELMI</td><td></td><td>或性能相当的设备。</td></tr><tr><td>人血清来源的 IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>用于检测的抗体</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>例如：PE 标记抗 CD63 抗体（556020）、PE 标记抗 CD9 抗体（555372）、PE 标记抗 CD81 抗体（555676）、同型对照抗体（555749）</td></tr><tr><td>BD FACSAria 流式细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transsonic T 490 DH 超声仪</td><td>ELMA</td><td></td><td>或性能相当的设备。</td></tr><tr><td>miRCURY RNA 提取试剂盒</td><td>Exiqon A/S</td><td>300110</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr></tbody></table>

含rna外泌体的分离与表征

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

外泌体研究领域正在迅速扩展，近年来相关出版物数量显著增加。这些起源于内吞作用的小囊泡（30-100 nm）最初被认为在网织红细胞向成熟红细胞分化过程中用于清除转铁蛋白受体1，之后被命名为外泌体。外泌体由晚期内体向内出芽形成多泡体（MVBs），并通过MVBs与质膜融合而释放到细胞外环境2。自外泌体首次被发现以来，已证实多种细胞均可释放此类囊泡。外泌体也在多种生物体液中被检测到，包括血浆、鼻腔灌洗液、唾液和母乳3-6。此外，研究已表明外泌体的内容物及其功能取决于其来源细胞以及生成条件。外泌体已被证实具有多种功能，例如诱导对过敏原的耐受7,8、在小鼠体内清除已形成的肿瘤9、抑制和激活自然杀伤细胞10-12、促进调节性T细胞分化13、刺激T细胞增殖14以及诱导T细胞凋亡15。2007年，我们证实肥大细胞释放的外泌体含有信使RNA（mRNA）和微小RNA（miRNA），且这些RNA可通过外泌体在细胞间转移。在接受细胞中，外泌体转移的mRNA可被翻译成蛋白质，提示转移的RNA具有调控功能16。此外，我们还发现，在氧化应激条件下培养的细胞所释放的外泌体能够诱导受体细胞对后续应激的耐受，从而提示外泌体RNA穿梭可能具有生物学功能17。细胞培养基和生物体液中含有多种囊泡和脱落的碎片混合物。因此，高质量的外泌体分离方法，结合对外泌体及其内容物的表征与鉴定，对于区分外泌体与其他囊泡和颗粒至关重要。本文介绍了一种从细胞培养基和体液中分离外泌体的方法。该分离方法基于多次离心和过滤步骤，最后通过超速离心将外泌体沉淀。文中重点介绍了用于鉴定外泌体以及表征其形态和蛋白质组成的重要方法，包括电子显微镜、流式细胞术和Western blot。外泌体总RNA的纯化基于离心柱层析法，外泌体RNA的得率和片段大小分布则通过Bioanalyzer进行分析。

本文展示了外泌体的分离、纯化与检测方法，以及对其分子成分进行分析的技术。这些方法适用于从细胞培养上清和生物体液中分离外泌体，不仅可用于分子成分分析，也可用于功能研究。

含RNA外泌体的分离与表征

外泌体研究领域正在迅速扩展，近年来相关出版物数量显著增加。这些小型囊泡（30-100 nm）的...

以下实验的总体目标是确定目标细胞和生物液体是否释放或含有RNA的外泌体。分离外泌体的第一步是去除细胞和细胞碎片。接下来，将上清液过滤以去除较大的颗粒。然后通过超速离心作为第二步将外泌体沉淀下来。通过电子显微镜、流式细胞术和蛋白质印迹分析对外泌体进行表征，以证明所分离的囊泡具有外泌体的形态大小和蛋白质组成。接下来，从纯化的外泌体中提取RNA。为了确定外泌体中含有哪种RNA，可通过这些成熟的外泌体纯化、检测与表征方法获得结果，从而促进对外泌体的进一步研究，例如其生物学功能。因此，本演示将向您展示如何通过不同方法分离外泌体，进行演示的两位是我的两名博士生，Maria, El 和 Cecelia。呃。祝好运。本实验采用人肥大细胞系HC one进行外泌体分离示范，以启动外泌体分离流程。首先，将细胞在含有无外泌体血清的培养基中培养。然后将细胞悬液转移至锥形管中，在4°C条件下以300 × g离心10分钟。为沉淀细胞，将上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以16,500 × g离心20分钟，以进一步去除细胞及细胞碎片。接着，将SANE通过0.2微米滤膜过滤，以进一步去除大于200纳米的颗粒。最后，将含有滤过SANE的超速离心管密封，在4°C条件下以120,000 × g超速离心70分钟，以沉淀外泌体。通过切开超速离心管，弃去上清液，并将富含外泌体的沉淀重新悬浮，从而回收外泌体。为最大限度回收外泌体，需将富含外泌体的沉淀在少量适当的缓冲液中反复重新悬浮于微量离心管中。用与之前相同体积的额外缓冲液冲洗两次。缓冲液的选择取决于外泌体分离后进行的实验类型。用于电子显微镜时，使用完整外泌体中约10微克的外泌体蛋白。重悬于PBS中进行操作。我们的碳膜镍网透射电子显微镜观察可不经过免疫染色，因为外泌体仅凭其大小和形态即可被识别。然而，建议使用如抗CD63或抗MHC II类分子的一抗，随后使用10纳米金标记的二抗进行孵育。由于外泌体体积过小，无法被当前的流式细胞仪设备直接检测，因此必须首先将外泌体与抗体包被的微珠结合。根据外泌体的细胞来源不同，可将不同的抗体偶联至磁珠或乳胶微珠上。在本实验中，每个样本均使用抗CD63包被的乳胶微珠。使用相当于完整外泌体中30至40微克外泌体蛋白的体积。将外泌体悬浮于PBS中，在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日，加入300微升200毫摩尔甘氨酸封闭，孵育30分钟。将外泌体-磁珠复合物用洗涤缓冲液洗涤两次，然后在4°C条件下，加入50微升IgG抗体孵育。再次将外泌体-磁珠复合物洗涤两次，向复合物中加入90微升洗涤缓冲液和10微升目标抗体，避光孵育40分钟。在轻柔振荡条件下，将外泌体-磁珠复合物洗涤两次，加入300微升洗涤缓冲液，转移样品至流式细胞术检测管中，使用流式细胞仪采集数据。本蛋白免疫印迹实验演示将重点介绍在进行蛋白免疫印迹前选择合适的蛋白质提取方法的重要性，以及所使用的不同抗体。将外泌体沉淀溶解于所选的蛋白裂解缓冲液中，充分吹打混匀，随后涡旋振荡以进一步裂解外泌体，将样品置于水浴超声仪中进行超声处理，然后以13,000 ×g 离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。采用所选方法测定总蛋白浓度，并将蛋白样品上样至凝胶中。然后通过凝胶电泳分离并转移蛋白质，再进行电转印，封闭并洗涤膜，随后对在外泌体中富集的蛋白质进行免疫染色，因为目前尚无外泌体特异性标记物。来源于不同细胞来源的外泌体中均富集的蛋白质通常用于外泌体检测。这些蛋白质包括四跨膜蛋白家族，例如 CD9、CD63 和 CD81。细胞骨架相关蛋白（如 ezrin）以及参与多泡体生成的蛋白（如 TSG101 和 LY）可作为检测其他区室来源囊泡中常见污染蛋白的阴性对照，例如内质网来源的 kexin 和 GRP78。根据计划进行的实验，可选用不同的RNA提取试剂盒。在本实验演示中，将采用基于柱的方法进行RNA提取。必须使用无核酸和无核酸酶的移液器吸头，并擦拭实验台面和设备以去除污染物和RNA。将外泌体沉淀物溶解于350 µL裂解液中，并涡旋混匀样品。加入200 µL 95%乙醇，使用涡旋振荡器混匀。将柱子放入收集管中，将裂解后的外泌体转移至柱子中并离心。用400 µL洗涤液洗涤三次，确保柱子完全干燥。最后一次洗涤后，在14,000 × g条件下离心2分钟，将干燥的柱子置于无RNA酶的EP管中，用50 µL洗脱缓冲液洗脱RNA，用于提取的总外泌体RNA的检测与分析。由于外泌体体积过小，无法通过现有的流式细胞术方法检测，因此可使用安捷伦 2100 生物分析仪配合 RNA 6,000 nano 或 RNA 6,000 pico 试剂盒进行分析。在分析前，外泌体需结合到抗体包被的微珠上。由于这些外泌体-微珠复合物可能发生聚集，流式细胞术散点图中可能包含单个、双联和三联外泌体-微珠复合物的不同群体。如图所示，箭头指示的是单个外泌体-微珠复合物群体，该群体将进行后续分析。流式细胞术直方图显示，单个外泌体-微珠群体对CD63蛋白呈阳性。空心曲线越偏右，表明样本中CD63的阳性程度越高。由于外泌体体积微小，只能通过电子显微镜观察。外泌体典型的形态学特征包括呈圆形、大小为30至100纳米的囊泡。图中显示了使用抗CD63金标抗体对外泌体进行免疫染色的结果，箭头所指处为Western blot结果。结果显示，在外泌体样本中不存在内质网蛋白calnexin，但存在四跨膜蛋白CD81，后者是外泌体中常见的富集蛋白。细胞RNA主要包含核糖体RNA，在此生物分析仪检测结果中表现为左侧18S核糖体RNA亚基和右侧28S亚基的两个峰。然而，外泌体RNA的谱型则有所不同，其核糖体RNA含量极少或几乎没有，富含短链RNA，如信使RNA和微小RNA。如果操作正确，分离过程大约需要三小时。使用该方法时，必须完成所有步骤，包括非过滤步骤，以避免较大囊泡的污染。该技术建立后，对外泌体的生化及生物学表征已变得简便得多。此外，我们对不同系统中由外泌体介导的细胞间通讯有了更深入的了解。同时，该技术也使得开发外泌体作为多种疾病的生物标志物成为可能。非常感谢您的关注。

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生物学

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