基于薄层色谱的酶活性测定:一种使用薄层色谱法测定体外焦磷酸激酶活性的技术

焦磷酸激酶催化二磷酸或焦磷酸从核苷酸前体（如三磷酸腺苷 ATP）转移到底物（如鸟苷二磷酸 GDP）。这形成了鸟苷四磷酸盐 - 一种重要的信号分子。

为了确定焦磷酸激酶活性，在补充有氯化镁的合适缓冲液中制备包含GDP和放射性标记ATP的反应混合物。将所需量的焦磷酸激酶加入反应混合物中并孵育。

，在镁离子存在的情况下，焦磷激酶开始将放射性标记的焦磷酸部分从 ATP 转移到 GDP，产生放射性鸟苷四磷酸盐。

现在，取薄层色谱或TLC，板上预涂有聚乙烯胺-纤维素 - 一种基于阳离子聚合物的固定相。在不同时间点将反应混合物分析物的等分试样点在TLC板基座附近，以停止反应并评估进展。

将板浸入含有磷酸二氢钾（一种流动相溶剂）的玻璃室中。随着溶剂前沿向上移动，带负电的分析物开始迁移，这取决于它们与带正电的固定相的亲和力。

不同磷酸化分析物的负电荷和重量的差异决定了它们在TLC板上的相对迁移，使它们能够固定为不同的条带。

当溶剂前端达到所需距离时，取下板并风干。测量放射性信号强度，对应于放射性标记的ATP耗竭和鸟苷四磷酸盐积累，以分析焦磷酸激酶活性。

进行反应之前，通过在去离子水中洗涤PEI-纤维素薄层色谱板来制备它们。将板放入装有双蒸馏水的玻璃室中，深度约为 0.5 厘米。让水迁移到板的顶部后，将板从玻璃室中取出，放在台架上晾干过夜。

用软铅笔在距一侧边缘 2 厘米处标记干板，以指示样品将应用于 TLC 的位置。对于 2 微升样品，应用样品的间隔不少于 1 厘米。计划实验时，始终在每个板上留一个点未使用，作为样品定量的空白通道。

要进行酶活性测定，请使用^γ-32P-ATP制备单个反应，如文本方案中所述。在其他组分混合后加入 RSH，因为将 RSH 添加到含核苷酸的混合物中会启动酶活性测定。

为了控制ATP水解免受核酸酶活性的污染，组装一个不含蛋白质的10微升反应，并平行孵育。在t = 0时和实验结束时点2微升样品，以确保ATP在没有蛋白质的情况下不会被水解。

添加RSH后，立即取出2微升，并将其点在标记的PEI-纤维素板上，作为t = 0分钟样品。

37摄氏度下孵育反应，在所需时间点取出2微升等分试样。收集所有等分试样后，通过用 1.5 摩尔磷酸二氢钾填充色谱室至 0.5 厘米深度来进行薄层色谱。将板的底部边缘浸入溶剂中，让溶剂在大约 90 分钟内迁移到板的顶部。

色谱罐中取出板，并将其放在台式晾衣架上风干过夜。板干燥后，用塑料薄膜包裹板，避免放射性物质转移到成像盒上，并通过放射自显影进行分析。

含有分离反应的PEI-纤维素板暴露在室温下磷光热像仪盒中四个小时。曝光后，在荧光成像仪上对盒进行成像。

使用带有图形用户界面的成像软件，首先选择"绘制矩形"来绘制感兴趣区域或 ROI。然后，使用鼠标在整个泳道周围绘制矩形 ROI，以及该泳道中包含的 ATP 和鸟苷四磷酸点。

使用"选择、复制和粘贴"命令在其他通道内绘制相同的 ROI，以确保 ROI 在每个通道的相同区域内测量信号。包括未使用通道的投资回报率，以用作空白。

使用"分析 |工具 |投资回报率管理器 |添加"命令，选择在PEI-纤维素板上绘制的所有ROI。现在，使用"分析 |设置测量值 |Measure"命令来量化每个 ROI 中的信号强度，并将测量结果导出为电子表格。在电子表格中，从实验信号中减去空白 ROI 值。