聚丙烯酰胺凝胶电泳:一种检测从小鼠肺组织中分离的不同链长硫酸乙酰肝素的分析技术

硫酸化糖胺聚糖，如硫酸乙酰肝素，HS，是带负电荷的、可变链长的线性、硫酸化多糖，附着在细胞表面蛋白上。

要估计从小鼠肺组织中分离的不同长度的HS，请从凝胶盒组装开始。用高浓度丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液部分填充，包括催化剂 - 过硫酸铵和四甲基乙烯二胺。与水覆盖以防止空气接触，这可能会抑制聚合。孵化。

催化剂诱导丙烯酰胺-双丙烯酰胺聚合，形成小孔溶解凝胶。倒掉水。加入低浓度丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液和催化剂。插入凝胶梳以创建孔。溶液聚合，形成大孔堆叠凝胶。

泳槽的腔室中装入运行缓冲液，以在电泳过程中获得最佳导电性。

HS混合物溶解在含有示踪染料和蔗糖的上样缓冲液中。接下来，将该混合物和标准 HS 分子量架转移到盒孔中。蔗糖将混合物限制在孔中。染料有助于监测电泳进程。

低电压下启动电泳。带负电荷的HS穿过堆叠凝胶，向带正电荷的阳极移动，并由于孔径差异而集中在堆叠分离凝胶界面。

增加电压。小链 HS 在分离凝胶中快速迁移，穿过更远，而长链 HS 则被困在凝胶基质内并缓慢移动。

电泳后，对凝胶进行染色。HS 表现为不同的条带，小链 HS 的位置低于长链 HS。单个 HS 的长度可以通过与 HS 标准进行比较来确定。

首先将一个空盒放入 PAGE 水箱中。通过将 10 毫升分离凝胶溶液与 60 微升新鲜制备的 10% 过硫酸铵混合在 15 毫升管中浇铸分离凝胶。然后，加入 10 微升 TEMED。轻轻倒置管子 2 至 3 次。

使用移液器将 10 毫升活性聚丙烯酰胺凝胶溶液快速添加到盒中。与 2 毫升去离子过滤水覆盖，让分离凝胶聚合 30 分钟。

分离凝胶完全聚合后，丢弃覆盖的水。通过将 3 毫升堆叠凝胶溶液与 90 微升新鲜制备的 10% 过硫酸铵混合在 15 毫升管中浇铸堆叠凝胶。然后，加入 3 微升 TEMED，轻轻倒置试管 2 至 3 次。

使用移液器将堆叠凝胶溶液快速添加到固化的分离凝胶上，直到盒装满边缘。完全插入空聚丙烯酰胺凝胶盒随附的梳子，让堆叠凝胶聚合 30 分钟。凝胶聚合后，从盒底部取下胶带条，然后将盒放回 PAGE 槽组件中。用相应的缓冲溶液填充上腔室和下腔室。

干燥的糖胺聚糖样品溶解在必要体积的最小体积的去离子过滤水中，并以 1 比 1 的比例与上样缓冲液混合。将样品和 HS 低聚糖分子量标准品加载到凝胶中。

100 伏电压下重新运行凝胶 5 分钟。然后，在 200 伏电压下运行 20 至 100 分钟，具体取决于分离凝胶溶液的丙烯酰胺百分比。