0 次观看 • 4:15 分钟 • July 8th, 2025
硫酸化糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素，HSs）是一类带负电荷、线性、硫酸化的多糖，其链长可变，通常连接在细胞表面蛋白上。
为了估算从小鼠肺组织中分离的不同长度的硫酸乙酰肝素（HS），首先开始凝胶 cassette 的组装。用高浓度的丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（包含催化剂——过硫酸铵和四甲基乙二胺）部分填充 cassette，然后覆盖水以防止与空气接触，避免抑制聚合反应。孵育。
催化剂可引发丙烯酰胺-双丙烯酰胺聚合，形成具有小孔径的分离胶。弃去水层。加入含有催化剂的低浓度丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。插入制胶梳以形成加样孔。该溶液聚合后形成具有大孔径的浓缩胶。
在电泳过程中，为获得最佳的电导性，需向电泳槽的上下室加入电泳运行缓冲液。
将HS混合物溶解于含有示踪染料和蔗糖的上样缓冲液中。接着，将该混合物和标准HS分子量标记物转移至胶盒的加样孔中。蔗糖可使混合物保留在加样孔内，染料则有助于监测电泳的进程。
在低电压下启动电泳。带负电荷的HSs穿过浓缩胶，向带正电的阳极移动，并由于孔径大小的差异而在浓缩胶与分离胶界面处富集。
增加电压。短链硫酸乙酰肝素（HS）会快速穿过分离胶，迁移得更远，而长链HS则会被凝胶基质截留，迁移缓慢。
电泳后，对凝胶进行染色。肝素硫酸盐（HSs）呈现为清晰的条带，短链HSs位于凝胶中比长链HSs更低的位置。通过与HS标准品比较，可确定各个HSs的长度。
首先将一个空胶盒放入PAGE电泳槽中。在15毫升离心管中，将10毫升分离胶溶液与60微升新配制的10%过硫酸铵混合，配制分离胶。然后加入10微升TEMED，轻轻倒置离心管2至3次。
使用移液器迅速向 cassette 中加入 10 毫升活化的聚丙烯酰胺凝胶溶液。随后覆盖 2 毫升去离子过滤水，静置 30 分钟使分离胶充分聚合。
待分离胶完全聚合后，弃去上层覆盖的水。在15毫升离心管中，将3毫升浓缩胶溶液与90微升新鲜配制的10%过硫酸铵混合，制备浓缩胶。然后加入3微升TEMED，轻轻倒置混匀2至3次。
使用移液器迅速将浓缩胶溶液加至已凝固的分离胶上方，直至玻璃板夹层充满至顶端。将空聚丙烯酰胺凝胶夹层配套的梳子完全插入，室温下静置30分钟，使浓缩胶充分聚合。待凝胶聚合完成后，从夹层底部撕去胶带条，并将夹层重新放入PAGE电泳槽组件中。向上下两个电泳室分别加入相应的缓冲液。
将干燥的糖胺聚糖样品溶解于最小必要体积的去离子过滤水中，按1:1比例与上样缓冲液混合。将样品和肝素寡糖分子量标准品加入凝胶中。
在100伏电压下重新电泳5分钟。然后根据分离胶溶液的丙烯酰胺百分比，在200伏电压下继续电泳20至100分钟。