用于RNA分析的变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种分离荧光标记的磷酸化RNA寡核苷酸与其非磷酸化对应物的技术

首先，取一个含有荧光标记的磷酸化与非磷酸化RNA寡核苷酸的样品，该样品已与含尿素的上样染料混合。加热样品。

尿素——一种强效变性剂——与加热共同作用可使RNA的二级结构变性，从而使其呈现线性化且无特定结构的构象。现在，将丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液与尿素混合，制备凝胶。

加入四甲基乙二胺（催化剂）和过硫酸铵（氧化剂），以促进后续凝胶的聚合反应。

将溶液倒入预先组装好的胶板装置中。插入梳子，以形成用于加样样品的加样孔。让凝胶充分聚合。将胶板放入电泳装置中。向上、下缓冲槽中加入电泳缓冲液，以维持电流在整个凝胶中的流通。移去梳子。

将与上样染料混合的样品加入上样孔中，并将凝胶连接至电源，设置所需的电压。凝胶中的尿素可使 RNA 分子以线性形式迁移。

凝胶起到分子筛的作用，允许带负电荷的RNA分子穿过孔隙向正极移动。在电泳过程中，由于磷酸化的RNA本身带有更强的负电荷，因此比未磷酸化的RNA迁移得更快。

对凝胶进行成像以检测荧光标记的RNA。观察磷酸化RNA与未磷酸化RNA之间的迁移率差异：磷酸化RNA迁移较快，在凝胶上表现为位置较低的条带。

配制15%变性丙烯酰胺凝胶溶液时，将22.5毫升预混的40% 29:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、6毫升10×TBE、28.8克尿素加入RNase-free水中，定容至总体积59毫升，然后轻轻搅拌溶液。

将溶液放入微波炉中加热20秒，搅拌后立即放回微波炉再加热20秒。轻轻搅拌溶液，直至尿素完全溶解。将玻璃烧杯置于盛有冷水的浅水浴中5分钟，确保烧杯周围的冷水液面高于烧杯内溶液的液面。待溶液冷却后，使用0.22微米的一次性过滤装置过滤并脱气，以去除颗粒物和微小气泡。

用肥皂和水清洗一块短玻璃板和一块长玻璃板。然后，用95%乙醇喷洒每块玻璃板，并擦拭以去除任何水分。将长玻璃板放置在盒子上，使其高于实验台面。接着，将0.4毫米的间隔垫条沿长玻璃板的长边放置。将短玻璃板叠放在长玻璃板上，确保短玻璃板、长玻璃板和间隔垫条的边缘对齐。然后，用三个间距均匀的金属夹子夹住两侧。

向丙烯酰胺溶液中加入 24 µL TEMED 并混匀。然后加入 600 µL 10% 过硫酸铵（APS），立即在玻璃板之间灌注该溶液。

将丙烯酰胺溶液倒入玻璃板夹层之间可能非常困难。为避免产生气泡，在倾倒溶液时应轻敲玻璃板夹层。

小心地将干净的32孔梳子插入玻璃板夹心中，并让丙烯酰胺聚合30分钟。

进行凝胶电泳时，将加热块温度设为75摄氏度，取下金属夹子，并彻底清洗和干燥玻璃板夹心结构。将玻璃板夹心结构放入电泳装置中，短板朝前。通过混合100毫升10X TBE缓冲液与1.9升无RN酶水，配制0.5X TBE电泳缓冲液。

向装置的上层和下层室中加入 600 毫升电泳缓冲液。轻轻取出凝胶中的梳子，并用注射器彻底冲洗加样孔。以 50 瓦功率预电泳 30 分钟，然后再次冲洗加样孔。

将终止反应的样品短暂离心，于75摄氏度孵育3分钟。再次短暂离心后，立即取10 µL每份样品上样至凝胶中。随后在50瓦功率下电泳运行3小时。电泳结束后，关闭电源，并排空装置上层腔室中的缓冲液。

清洗并擦干玻璃板夹心装置的外侧。然后用锡箔纸包裹，并将其转移至激光扫描仪进行成像。将玻璃板夹心装置固定在激光扫描仪的载物台上，设置目标荧光染料的激发波长和发射波长，然后对凝胶进行成像。