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生物学技术
0 次观看 • 6:59 分钟 • July 8th, 2025
多聚体蛋白质复合物对于多种生物学过程至关重要。
为了通过多聚体-PAGE 在天然状态下分离蛋白质复合物，需取含有目标复合物的组织裂解液，并将该裂解液上样至用于蓝色天然PAGE的凝胶装置中。
用含有蓝色阴离子染料的碱性电泳缓冲液填充系统，并将其连接至电源。在碱性 pH 条件下，染料分子会结合到蛋白质复合物上，使其整体带负电荷，但不会使其变性。这种带负电荷的完整蛋白质复合物在凝胶中以蓝色条带的形式迁移。
在进行最短时间电泳后，待完整蛋白质迁移至分离胶，切下含有复合物的胶条。将胶条孵育在含有交联剂的溶液中，使其活性基团与邻近蛋白质的氨基发生反应，从而稳定多聚体复合物。
用淬灭试剂替换交联溶液，以终止未反应交联剂的活性。加入SDS（一种阴离子去污剂），使完整的蛋白质复合物带上均匀的负电荷，同时保持其天然大小和组成不变。
将处理后的条带放入新的胶盒中，并重新灌制新的SDS-PAGE凝胶。电泳过程中，带负电荷的交联蛋白复合物向正极阳极迁移，并在凝胶中表现为高分子量条带。
开始此实验步骤前，按照文本方案中的描述准备好蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电极连接至电源，以150伏电压在凝胶中进行蛋白质电泳，直至染料条带进入分离胶约2厘米处。此时停止电泳，并断开电源连接。
拆卸电泳装置后，分离凝胶夹心板的玻璃板。移除并丢弃浓缩胶层。
小心地在染料前沿的下边缘稍下方切割凝胶，注意使切口尽可能平滑且笔直。然后，弃去未使用的凝胶部分。修剪掉凝胶条边缘的所有未使用部分。
将条带小心放入盛有10毫升磷酸盐缓冲液的小容器中，通过温和振荡孵育30分钟以达到平衡。平衡后，弃去PBS并更换为另外10毫升PBS。
用移液器将500微升溶于二甲基亚砜中的25毫摩尔DSP加入PBS中，继续以之前的方式混合30分钟。30分钟后，倒出DSP溶液。加入10毫升含2%十二烷基硫酸钠的0.375摩尔Tris-HCl（pH 8.8），以淬灭未反应的DSP。继续旋转孵育15分钟。
在凝胶条进行淬灭的同时，根据标准方法配制SDS-PAGE凝胶溶液，但不要加入聚合试剂。淬灭完成后，将蓝色天然凝胶条恢复至室温，并将其嵌入新的凝胶板中。
为此，请小心拿起凝胶并将其放置在干净的凝胶盒间隔板上。调整胶条方向，使其相对于之前的方向翻转，染料前沿的底部靠近新胶盒的顶部。
将胶条放置，使其上边缘与盖板上边缘对齐。确保染料前沿与玻璃板的水平边缘平行。将切下的胶条一侧紧贴一侧间隔壁，另一侧留出空间用于灌胶，并预留加载蛋白质标准品或蛋白ladder的位置。若胶条底边存在任何参差不齐或不平整的区域，应小心将其切除。
当凝胶条位置正确后，将盖板覆盖在间隔板上。轻轻按压以排出任何滞留的气泡。随后根据制造商的说明继续组装凝胶灌制装置。
放置上层板时，凝胶条有时会发生偏移。可使凝胶条略微悬出上层板边缘，以便用刮刀进行调整，纠正任何偏移。
将聚合试剂加入
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