二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种基于电荷和分子量分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的分析技术

对于来自匀浆化肿瘤组织的蛋白质混合物进行二维凝胶电泳时，需使用含有变性剂、两性离子去污剂和还原剂的缓冲液进行处理。变性剂和去污剂可使蛋白质变性并溶解。还原剂可还原蛋白质的二硫键，产生游离的巯基，并使蛋白质展开，从而实现最佳的蛋白质分离效果。 

将处理后的蛋白质混合物转移至固定化 pH 梯度（IPG）胶条槽中。将含有线性 pH 梯度的 IPG 胶条放入聚丙烯酰胺凝胶基质内。加入矿物油以防止蛋白质溶液蒸发。将胶条槽放入等电聚焦（IEF）系统中。使蛋白质溶液充分重悬并水化胶条。

进行第一维等电聚焦电泳（IEF）。电流作用下，带电蛋白质在pH梯度中向相反电荷的电极迁移，并在其各自的等电点处固定，即蛋白质净电荷为零时的pH值。

等电聚焦（IEF）后，用阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）处理IPG胶条，使蛋白质带上负电荷。随后用烷基化试剂平衡，以修饰蛋白质的巯基，确保蛋白质在电泳过程中的溶解性。

将胶条加载到预制的小孔聚丙烯酰胺分离胶上，并用熔化的琼脂糖固定。用含有SDS的电泳缓冲液填充电泳槽。启动第二向电泳，其方向垂直于第一向等电聚焦（IEF）。

带负电荷且分子量较大的蛋白质向带正电的阳极移动时，在凝胶中的迁移速度较分子量小的蛋白质更慢，从而实现基于分子大小的分离。

染色凝胶。蛋白质可在凝胶上显示为清晰的斑点。

开始此操作时，将 250 微升预先配制的蛋白质样品溶液加入到 13 厘米 IPG 胶条槽的每个槽中。将一条 18 厘米的 IPG 胶条（凝胶面朝下）放置在每份蛋白质样品溶液上，注意避免产生气泡。然后，加入 3 至 4 毫升矿物油以覆盖每条 IPG 胶条。

接下来，将每条IPG胶条支架安装到等电聚焦系统中，尖端置于后板，方形端置于前板。在室温下对IPG胶条进行18小时的水化后，设置等电聚焦系统的IEF参数，总运行时间为7.5小时，总电压时数为36,875伏特小时。

等电聚焦（IEF）完成后，从等电聚焦仪中取出每条IPG胶条，用不溶性纸巾擦去多余的矿物油。然后，用塑料薄膜包裹每条胶条，并于-80摄氏度保存。

制备12%的PAGE凝胶时，将双蒸水、1.5摩尔Tris-盐酸缓冲液、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存液、10%过硫酸铵和TEMED加入烧杯中。轻轻混匀凝胶溶液，注意避免产生气泡。

将凝胶溶液轻轻倒入多联制胶室中，至预期的19厘米凝胶高度。立即向多联制胶室中加入约3毫升双蒸水，覆盖每一层分离胶，并让每块凝胶聚合约一小时。

此步骤对于制备高质量的SDS-PAGE凝胶非常重要。必须立即在每块凝胶的顶部加入等体积的水。

配制两升电泳缓冲液，然后将缓冲液加入电泳分离装置的缓冲液槽中。

从冷冻箱中取出聚焦好的IPG胶条后，将其放入含有1毫升还原平衡缓冲液和少量溴酚蓝的塑料容器中，在轻轻摇动的条件下平衡10分钟。倒去还原平衡缓冲液后，向IPG胶条中加入4毫升烷基化平衡缓冲液和少量溴酚蓝，在轻轻摇动的条件下继续平衡10分钟。

在凝胶平衡过程中，拆开多用制胶室，取出已制备的分离胶板。用双蒸水冲洗凝胶板三次，然后用不掉屑的纸巾吸去凝胶板上的多余水分，并将其放入凝胶支架中。

随后，用电泳缓冲液冲洗已平衡的IPG胶条，并用不掉屑的纸巾吸去每根IPG胶条表面多余的液体。将IPG胶条放置于分离用SDS-PAGE凝胶上，使IPG胶条的塑料面接触较长的玻璃板，尖端朝左。

现在，迅速加入 3 至 4 毫升热的 1% 琼脂糖和 SDS 电泳缓冲液，将 IPG 胶条密封在每块 SDS-PAGE 胶的顶部，并将 IPG 胶条的上侧朝下放置在较短的玻璃板顶部，注意避免产生气泡。

这些步骤对于将IPG胶条密封到SDS-PAGE凝胶上至关重要。必须立即加入热的琼脂糖溶液，并立即将IPG胶条放置于SDS凝胶的顶部。

聚合完成后，将组装好的凝胶板垂直插入塑料垫片和垂直电泳系统之间。将带有IPG胶条的凝胶上端靠近阴极放置。随后，向电泳系统中加入适量电泳缓冲液，调节缓冲液液面高度，使凝胶板完全浸入缓冲液中。

将电源连接并设置为恒压模式，以200伏电压运行约370分钟，同时监测染料迁移情况。电泳完成后，从电泳装置中取出凝胶盒，并小心地从凝胶盒中取出凝胶，注意避免撕裂凝胶。