明胶酶谱电泳：一种通过检测酶活性来分析基质金属蛋白酶的电泳技术

基质金属蛋白酶（MMP）是一种多结构域蛋白酶，包含前肽和催化结构域，由特定细胞以无活性酶或酶原形式分泌。催化结构域中的锌离子与前肽结构域中的半胱氨酸残基相互作用，使MMP保持无活性状态。

通过明胶酶谱凝胶电泳检测细胞培养上清液中的基质金属蛋白酶（MMPs）时，将含有凝胶盒的电泳槽中加入含十二烷基硫酸钠（SDS）的电泳缓冲液。

将含有上样缓冲液的培养上清液以及蛋白质标准品加入到聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，该凝胶共聚有MMP特异性的蛋白质底物。

SDS 是一种带负电荷的去污剂，在非还原条件下可破坏基质金属蛋白酶（MMPs）中的半胱氨酸-锌相互作用，使蛋白质变性，同时赋予其负电荷。

进行电泳。电场会使带负电荷的蛋白质向带正电的阳极迁移，从而实现蛋白质按分子大小的分离。

电泳结束后，用含有非离子型去污剂的变性缓冲液处理凝胶。非离子型去污剂可取代SDS，使蛋白质复性，并部分恢复基质金属蛋白酶（MMP）的活性。MMPs 进一步被加工转化为完全活化状态。

在含有对基质金属蛋白酶（MMP）活性至关重要的二价金属阳离子的显色缓冲液中孵育。具有活性的MMP在阳离子存在下消化凝胶中的MMP底物。洗涤凝胶以去除消化产物。对凝胶进行染色。

MMP 活性区域因缺乏 MMP 底物，在未消化底物的深蓝色背景下呈现为清晰的条带。使用适当的软件，可将凝胶条带强度与 MMP 活性相关联。

在开始本方案之前，应充分准备所有基质金属蛋白酶（MMPs），以维持酶的活性。样品可立即使用，或在 -80 摄氏度下保存。此处以 MMP-2（也称为明胶酶 A 或 IV 型胶原酶）为例，演示通过酶谱法可视化 MMP 活性的过程。

制备好MMP酶后，取一个含有凝胶的10%明胶zymogram凝胶袋（置于胶盒内）。用去离子水冲洗胶盒。移除胶盒底部的保护胶带以及凝胶顶部的梳子。用Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液冲洗加样孔三次。

将凝胶放入小型电泳装置中，确保胶板匣较小的一侧朝内。使用凝胶固定楔锁紧凝胶。向装置的上层电泳槽中加入Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液，液面需高出加样孔，同时检查是否存在泄漏。同样向凝胶电泳装置的下层电泳槽中加入电泳缓冲液。

然后，加入10 µL蛋白质分子标记物。

将等量的样品与不含还原剂的上样缓冲液混合。与常规SDS-PAGE不同，样品无需煮沸，而是直接使用上样枪头将样品加入凝胶的加样孔中。每个加样孔最多可容纳20微升体积。

将盖子盖在迷你电泳槽上，并将电极导线连接到电源。打开电源，将电压设定为125伏，恒压运行90分钟。观察下层室电极导线上是否有微小气泡产生，以确认电流的流通。

进行第一块凝胶电泳时，每15分钟监测一次迁移进程，以加样缓冲液中的溴酚蓝作为指示剂。每块凝胶需用去离子水配制100毫升1X酶谱重折叠缓冲液和200毫升酶谱显色缓冲液。

当溴酚蓝示踪染料迁移至凝胶底部时，关闭电源。

打开小型电泳槽，取出凝胶。使用凝胶刀分离夹板的两侧。切去一个角以标记凝胶的方向。小心地将凝胶从夹板中取出，并将其放入含有100毫升变性缓冲液的容器中。

将凝胶在室温下轻轻振荡孵育30分钟。

移除变性缓冲液，向凝胶中加入 100 毫升显色缓冲液。在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。

然后，移除显影缓冲液，并向凝胶中加入额外的 100 毫升新鲜显影缓冲液。在 37 摄氏度下孵育凝胶过夜。

经过过夜孵育后，移除显影缓冲液，并用去离子水在室温下轻轻振荡孵育凝胶5分钟以进行洗涤。重复此洗涤步骤两次。

将凝胶置于塑料文件保护膜上，去除气泡。然后使用图像扫描仪扫描凝胶，以保存蛋白标准品条带的精确位置，因为这些条带在凝胶染色后将变得几乎不可见。

通过向凝胶中加入 20 毫升 SimplyBlue SafeStain 对凝胶进行染色。在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。

移去SimplyBlue SafeStain，再将凝胶置于100毫升去离子水中，在室温下轻轻振荡进行脱色。

1小时后，更换为新鲜的去离子水，并继续孵育凝胶至少1小时。