多分析物免疫珠检测：一种基于流式技术的免疫分析方法，用于同时检测人血清样本中的多种抗体亚型

多重分析物免疫微球检测利用多种包被抗原的微球，同时识别其相应的靶抗体。

开始本实验时，取含有适当缓冲液的试管中的微珠混合物。每个微珠表面均包被有特定抗原，从而可轻松区分不同微珠。

用移液器将包被的免疫磁珠混合物加入微孔板的各孔中。向各孔中加入含有不同同种型靶抗体的血清样本。这些抗体亚型在结构上存在细微差异，从而使每个孔中可含有多种不同的特异性抗体。

孵育，使样本中的抗体同种型与相应免疫磁珠上捕获的特异性抗原结合。用检测缓冲液洗涤，去除未结合的一抗。加入针对每种一抗变体的荧光标记二抗至孔中。

每种标记的二抗与相应的一抗的 Fc 位点结合。多个被磁珠捕获的抗原-一抗复合物被荧光标记。洗涤反应板以去除未结合的二抗。

使用能够同时在各自波长下检测不同荧光染料的荧光分析仪读取酶标板。根据信号检测结果，可评估血清抗体的各种同种型及其与不同抗原的结合情况。

为保证检测性能，将偶联微球涡旋振荡30秒重悬，并超声处理60至90秒。然后，从各管中取出所需量的每种微球胶体，将微球胶体混合至新的1.5毫升微量离心管中。

接下来，将试管放入磁力分离器中，静置分离60秒。试管仍置于磁力分离器中时，移除上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。

从分离器中移除磁珠后，将磁珠重悬于100微升的检测缓冲液中。涡旋振荡30秒，然后将离心管放入磁力架中静置60秒，以分离磁珠。重复洗涤两次。

接下来，通过加入适量的检测缓冲液，调整三重工作微球混合物的浓度，使每种目标物的最终浓度为每 1 µL 含 100 个微球。

将25微升微球混合物分装至96孔板的每个孔中。用检测缓冲液将血浆或血清样本稀释500倍，并根据所需滴定度制备标准品样本。

向96孔样本板的每个指定孔中加入25微升检测缓冲液作为空白样本，并加入各稀释后的样本或标准品。完成后，用铝箔封板膜或铝箔覆盖板孔，在室温下置于设定为700转/分钟的板式摇床上孵育1小时。

按照文中的描述，使用检测缓冲液将抗人检测抗体或二抗溶液配制为 4 µg/mL 的浓度。将板置于磁力架上快速洗涤，然后用力将板倒置在生物危害容器上方，以去除孔中的液体。保持板倒置状态，用力将板在一团厚实的纸巾上敲击。

然后，每孔加入 100 微升检测缓冲液洗涤，通过将板倒置在生物危害容器上方并用力敲击以去除液体。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将所有使用过的纸巾弃入生物危害容器中。

接下来，向96孔板的每个孔中加入25 µL二抗工作液，用铝箔纸覆盖后，在700 rpm的振荡器上孵育。

孵育30分钟后，用检测缓冲液将平板的孔清洗两次，操作方法如前所述。然后，向96孔板的每个孔中加入100 µL检测缓冲液。用铝箔纸覆盖平板，在室温下于平板摇床上孵育5分钟。

根据仪器系统手册，使用仪器分析仪分析60微升样品。