磷脂酶活性检测：一种凝胶扩散法测定 Anthopleura dowii 粗毒提取物中磷脂酶活性的方法

磷脂是含有磷酸基团的复杂脂质。这些分子可被一种称为磷脂酶的酶水解。

进行磷脂酶活性测定，需取富含磷脂的蛋黄乳液，其中磷脂作为酶的底物。将蛋黄加入含有氯化钠的温热琼脂糖溶液中，氯化钠可在后续步骤中增强蛋黄蛋白的稳定性。

向混合物中加入氯化钙和荧光染料——罗丹明。将混合物倒入培养皿中。凝固后，卵黄磷脂在琼脂糖凝胶基质中保持均匀分布。

使用移液管在凝胶中制备间距适当的孔穴。将含有磷脂酶的不同浓度粗蛋白提取物加入孔穴中。在生理温度下孵育该平板。

提取物中的磷脂酶向凝胶中径向扩散。凝胶中的钙离子与磷脂酶结合，激活该酶。该酶可切割磷脂，生成游离脂肪酸。凝胶中的罗丹明分子与释放的脂肪酸形成复合物。

在紫外光照射下，观察孔周围是否出现荧光晕环。晕环的出现表明存在酶活性。随着磷脂酶浓度的升高，酶分子扩散得更远，导致晕环直径增大。

用含 1% SDS 的蒸馏水清洗一个鸡蛋，并在无菌条件下将蛋黄与蛋清分离。

配制溶液 A、B、C 和 D。向溶液 B 中加入 500 微升的溶液 A 和 C，以及 100 微升的溶液 D。混匀后，将 25 毫升混合液倒入每个培养皿中。在无菌条件下等待溶液凝固，并用细管制备直径约为 2 至 3 毫米的孔洞。

在一个孔中加入总共 20 微升磷酸盐缓冲液作为阴性对照，在另一孔中加入 20 微升已知的磷脂酶作为阳性对照。

在其余各孔中分别加入不同量的粗提蛋白提取物——5、15、25、35 和 45 微克，每孔终体积为 20 微升。在 37 摄氏度下孵育 20 小时。