环形微图案细胞手性检测法：一种基于环形微图案上细胞排列的多细胞手性体外检测技术

为了确定体外哺乳动物细胞的手性——即在受限条件下细胞向左或向右定向排列的左右偏向性——首先使用定制的镀金载玻片，将其置于含有培养基的多孔板中。这些载玻片包含环形的纤连蛋白微图案岛，该蛋白可促进细胞黏附，背景则填充了抵抗细胞黏附的自组装单分子层。

接下来，将适量的哺乳动物细胞悬液接种到载玻片上并进行孵育。细胞会吸附在含有纤连蛋白的环形微图案上。周围的自组装单分子层可防止细胞在环形边界外发生非特异性黏附。

更换培养基，去除未贴壁的细胞，并加入新鲜培养基。向其中一组玻片添加干扰肌动蛋白的药物，然后进行孵育。

黏附的细胞增殖并铺展，呈现出下方纤连蛋白岛的形状，同时根据空间信号重排其肌动蛋白纤维，从而限制细胞单层的扩展，促进定向排列。

现在，用多聚甲醛处理载玻片以固定细胞。在相差显微镜下，环形微图案上的细胞呈现为暗区，其轮廓明亮，并沿其偏好方向排列。

利用软件计算每个细胞的排列角度，即相对于环形周向的偏离角度。通过取平均值来确定哺乳动物细胞的手性。经细胞骨架肌动蛋白干扰药物处理的细胞可能表现出相反的手性。

接种细胞前，将培养基和胰蛋白酶在37摄氏度的水浴中预热。

为了促进细胞更好地贴壁，将带有图案的载玻片浸入含有培养基的12孔板中，并在37摄氏度的培养箱中预热。细胞经胰酶消化后，使用含FBS的培养基中和。在100 × g 条件下离心3分钟，使细胞沉淀，随后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞，并将细胞悬液稀释至浓度为每毫升20万个细胞。

向每个含有金片的孔中加入 0.5 毫升细胞悬液。轻轻振荡培养板数次，使细胞接种均匀，然后孵育 15 分钟以促进细胞贴壁。15 分钟后，在显微镜下检查细胞贴壁情况，如有需要，可继续孵育一段时间。

细胞贴壁后，吸出各孔中含未贴壁细胞的培养基，每孔加入1毫升新鲜培养基。将细胞在培养箱中继续培养24小时，观察汇合度以判断是否形成手性结构。

当细胞达到所需汇合度时，移除培养基以固定细胞。用 PBS 洗涤一次后，向玻片上加入 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟，再用 PBS 洗涤三次。

为获取图像，使用带相机功能的相差显微镜，以高分辨率拍摄载玻片上的每个环。

为了进行手性表征，请下载 MATLAB 代码文件。将代码文件夹及其子文件夹添加到 MATLAB 路径中，并打开“ROI_selection.m”文件。在第 4 行，将目录更改为所需的数据文件夹。

在第14行中更改图像大小，前两个数值表示环的内圆尺寸，后两个数值表示外圆尺寸。

为了在相差图像中确定感兴趣区域（ROI），请通过点击运行按钮执行 MATLAB 代码“ROI_selection.m”。手动拖动选择框以贴合环形区域，然后在图像上双击以确认选择。

在从文件夹中的所有图像中选择感兴趣区域（ROI）后，系统将生成一个“.mat”文件，用于存储每幅图像的ROI信息。然后，打开“Analysis_batch.m”文件，并按照之前的方法修改文件夹目录。单击运行按钮，执行“Analysis_batch.m”代码，以确定多个细胞环状模式的手性。

将生成一个“datatoexcel.txt”文件，其中包含每个环的圆形统计学数据，以及顺时针、非手性和逆时针环的数量。