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中和抗体(NAbs)由细胞分泌,用于保护细胞免受入侵病毒的侵害。
为了研究中和抗体(NAbs)与病毒的相互作用,可使用经过基因工程改造的病毒样颗粒(VLPs)。这些纳米级结构包含来源于病毒的蛋白质组装体,但不含病毒遗传物质,因此不具有感染性。VLPs 被脂双层包裹,其上嵌有抗原性包膜糖蛋白,可呈现中和表位——即 NAbs 特异性结合的特定区域。
将VLPs加入含有与蛋白偶联的磁珠结合的中和抗体的离心管中。在振荡条件下孵育,以防止磁珠沉降。孵育过程中,VLPs的表位区域识别中和抗体Fab区上互补的互补决定区(paratope),从而形成抗原-抗体复合物。这进而有助于磁珠捕获VLPs。
将试管放入配备强磁铁的分离架中。在磁场作用下,与病毒样颗粒(VLPs)结合的磁珠会向磁铁方向移动,同时不干扰抗原-抗体相互作用。此步骤可捕获已结合的VLPs,而缺乏特异性抗原的VLPs则保留在上清液中。
弃去上清液,用洗涤缓冲液洗涤沉淀,以去除未结合的病毒样颗粒(VLPs)。将VLP-磁珠复合物重悬于洗脱缓冲液中,使VLPs从磁珠上解离并进入上清液。
将分离出的抗原展示型VLP吸入新试管中,并于冷藏条件下保存以供进一步分析。
首先通过反复吹打或在50 RPM的旋转仪上混匀至少5分钟,重新悬浮磁珠。
同时,配制含有广谱中和抗体(bNAbs)的抗体溶液。每个反应使用每种bNAb 10微克,并加入200微升抗体结合与洗涤缓冲液。每个反应中,将50微升磁珠溶液转移至1.5毫升反应管中,然后将反应管置于磁力分离架上。
等待磁珠聚集到管壁,以确保收集全部磁珠,然后移除上清液。取下磁铁,并将磁珠重悬于200 µL预先配制的广谱中和抗体(bNAb)溶液中。
在室温下于50 RPM的旋转仪上混匀,孵育30分钟至3小时。孵育结束后,将反应管置于磁力分离架上,静置,然后移除上清液。
将离心管从磁力架上取下,加入200 µL抗体结合与洗涤缓冲液重悬磁珠以洗涤。重复使用抗体结合与洗涤缓冲液洗涤一次,每次洗涤结束后尽量吸除尽可能多的洗涤缓冲液。
将样品加入到磁珠结合的广谱中和抗体(bNAbs)中。如果加入的样品体积低于1毫升,需添加PBS调整样品体积至1毫升,然后通过轻柔吹打重悬磁珠。将样品与磁珠在室温下于旋转仪上孵育2.5小时,确保磁珠保持悬浮状态,并在孵育过程中充分混匀溶液。
将离心管置于磁力架上,移除上清液。随后用200 µL洗涤缓冲液重悬磁珠以进行洗涤。将磁珠重悬于100 mL洗涤缓冲液中,转移悬液至一支洁净的耐热反应管中。将离心管置于磁力分离架上,彻底移除上清液。
为制备变性的SDS-PAGE样品,将磁珠重悬于20至80微升Laemmli缓冲液中,在95摄氏度孵育5分钟。随后直接进行SDS-PAGE,将离心管置于磁力架上以分离磁珠与溶液。或者,可将样品在-20摄氏度保存。