Name: 基于一个基质胶管形成实验，以评估对肿瘤细胞的血管生成活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: 学习利用基质胶管形成实验评估肿瘤细胞体外血管生成活性，通过成像和定量分析不同细胞类型的成管能力。该方法为研究肿瘤血管化机制及开发靶向治疗策略提供重要依据。

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本工作由 NCI R01 CA120659（RS）资助。

1. 一种基于Matrigel的管状结构形成实验，用于评估肿瘤细胞的血管生成活性
<ol>
 <li>肿瘤细胞与微血管内皮细胞的制备：将脑肿瘤细胞（如 U87 细胞）、黑色素瘤细胞 B16F1、乳腺癌细胞 MDA-MB-435 以及结肠癌细胞 HCT116 在添加 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（均来自 Invitrogen）的 DMEM 培养基中培养。人微血管内皮细胞系（HMVECs）则在 EBM2 培养基（Lonza）中培养，该培养基添加了 1 μg/ml 氢化可的松、1 ng/ml 表皮生长因子、10% FBS 及青霉素/链霉素。细胞用 PBS 洗涤三次后，使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen）消化脱落。以 2,000 rpm 离心 5 分钟后，再次用 PBS 洗涤细胞沉淀。随后用血细胞计数板对细胞沉淀进行计数。</li>
 <li>Matrigel 准备：取一份生长因子减少型 Matrigel（BD Bioscience），在室温下预温。在尚未完全解冻前转移至冰上，并将液体置于冰上至少保持 10 分钟。然后将 50 μl Matrigel 加入平放的 96 孔板中，使其均匀分布，并在 37°C 下孵育 30 分钟。</li>
 <li>管状结构形成：将肿瘤细胞或内皮细胞（1–2 × 104）重悬于无血清的 DMEM（肿瘤细胞）或 EBM-2（内皮细胞）培养基中，接种至 Matrigel 表面。若该实验用于检测某些试剂对管状结构发育的影响，则将这些试剂（激动剂或抑制剂）加入无血清培养基中。每个实验条件组包含 4–6 个孔。</li>
 <li>图像与数据分析：在 37°C 下孵育过夜后，直接在显微镜下分析每孔。若需固定管状结构，可轻柔加入 100 μl 10% 甲醛生理盐水溶液，10 分钟后即可进行分析。在 10× 相差显微镜下拍摄每个视野中的管状结构，并对每孔中 3–5 个随机视野的平均管状结构数量进行计数。</li>
</ol>
2. 典型结果：

HMVECs 被用作阳性对照，因为这些管状结构由清晰的细长细胞体延伸并相互连接形成多边形网络。B16F1、U87 和 MDA-MB-435 细胞形成的血管样管状结构与 HMVECs 形成的结构相似，但 HCT116 细胞则不能（图 1）。在 U87 细胞中检测了细胞剂量依赖性的管形成能力。如图 2 所示，10,000 个细胞形成了不连续的管状结构。当细胞数量增加一倍后，形成的完整血管网络与 HMVECs 中观察到的结构相当。相比之下，细胞数量少于 5,000 时则无法形成血管表型。
<img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="细胞培养形态学比较；HMVEC、U87、HCT116、MDA-MB-435、B16F1 细胞的显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. HMVEC、U87、MDA-MB-435 和 B16F1 细胞诱导形成管状结构，而 HCT116 细胞则不能。 所有细胞（2 × 104）接种于 Matrigel 上，并培养过夜。使用相差显微镜观察管状结构。HMVEC 作为阳性对照。展示的是 3–5 个视野的代表性图像。标尺：100 μm。
<img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="细胞生长比较，用于分析的不同密度的HMVEC与U87细胞显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. U87细胞以细胞数量依赖的方式诱导管状结构形成。 如图角标所示，使用不同数量的U87细胞进行管形成实验。HMVEC细胞作为阳性对照。比例尺：100 mm。

<ol><li>Shao, R., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvascular+endothelial+cells+immortalized+with+human+telomerase+catalytic+protein%3A+a+model+for+the+study+of+in+vitro+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis.</a> Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).</li>
<li>Ribeiro, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostatic+properties+of+the+SV-40+transfected+human+microvascular+endothelial+cell+line+%28HMEC-1%29.+A+representative+in+vitro+model+for+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium.</a> Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).</li>
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<li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+expression+of+periostin+by+human+breast+cancers+promotes+tumor+angiogenesis+through+up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression.</a> Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).</li>
<li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YKL-40%2C+a+secreted+glycoprotein%2C+promotes+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis.</a> Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).</li>
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<li>Scavelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+by+bone+marrow+macrophages+in+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma.</a> Oncogene. 27, 663-674 (2008).</li>
<li>El Hallani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+alternative+mechanism+in+glioblastoma+vascularization%3A+tubular+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22+Brain%22%5BJournal%5D)">A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry.</a> Brain. 133, 973-982 (2010).</li>
<li>Maniotis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+channel+formation+by+human+melanoma+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry.</a> American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).</li>
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<li>Folberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+plasticity+in+uveal+melanoma%3A+microenvironment+directed+dampening+of+the+invasive+and+metastatic+genotype+and+phenotype+accompanies+the+generation+of+vasculogenic+mimicry+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.</a> American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+membrane+antigen+directed+selective+thrombotic+infarction+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors.</a> Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma%3A+implications+for+anti-vasculogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li>
<li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li>
<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为了确保本实验成功，应首先测试 Matrigel 的质量。可从 BD Bioscience 获取少量样品，使用 HMVEC 进行预实验。不同批次的产品可能表现出不同的质量，部分批次无法为管状结构形成提供最佳条件。其次，在将 Matrigel 分装至 96 孔板时应避免产生气泡，因为气泡会干扰管状结构的形成。如果在孔中发现微小气泡，可立即将 Matrigel 移回原始的 Matrigel 管中，实验过程中这些管子应始终保持在冰上。此外，所用细胞应维持在对数生长期的生长速率。当培养条件显示细胞生长缓慢时，应更换为状态良好的细胞。最后，若未对形成的管状结构进行固定，则在显微镜下观察的时间不应超过一小时，因为温度降低（室温）可能影响管状结构的形成。整个实验应在 24 小时内完成，以避免因细胞死亡导致管状结构破坏。众所周知，管状结构的形成涉及多种细胞激活过程，包括细胞迁移、细胞间黏附、存活和凋亡。例如，在管状结构发育过程中，细胞迁移和细胞间黏附现象明显。然而，24 小时后，随着网络结构逐渐中断，细胞凋亡显著发生。该现象在内皮细胞和肿瘤细胞衍生的管状结构形成中均可见到。
目前研究表明，该检测方...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>47743-720</td><td></td></tr><tr><td>EBM2试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TS100显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于matrigel的管形成实验，用于评估肿瘤细胞的血管生成活性

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

在过去的几十年中，通常采用使用生长因子减少型Matrigel的管形成实验来证明血管内皮细胞在体外的血管生成活性in vitro1-5。然而，近年来越来越多的证据表明，该实验并不仅限于检测内皮细胞的血管行为，还被用于检测多种肿瘤细胞形成血管样表型的能力6-8。这种能力与其在异种移植动物模型中观察到的血管生成样行为一致，该过程被称为血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）9。大量证据表明，肿瘤细胞介导的VM在肿瘤发育过程中发挥着至关重要的作用，且独立于内皮细胞的血管生成过程6, 10-13。例如，在黑色素瘤和胶质母细胞瘤患者的组织样本中发现，肿瘤细胞可参与血液灌注的血管样通道的形成8, 10, 11。在此，我们描述了这种管状网络实验作为评估肿瘤细胞血管生成活性的有效工具。我们发现，某些肿瘤细胞系（如黑色素瘤B16F1细胞、胶质母细胞瘤U87细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞）能够形成血管样管状结构，而另一些细胞（如结肠癌HCT116细胞）则不能。此外，这种血管样表型依赖于接种在Matrigel上的细胞数量。因此，该实验可作为一种强有力的工具，用于筛选包括血管细胞、肿瘤细胞及其他细胞在内的多种细胞类型的血管形成潜能。

管形成实验用于评估肿瘤细胞的血管活性。

一种基于Matrigel的管形成实验，用于评估肿瘤细胞的血管生成活性

在过去的几十年中，通常采用使用生长因子减少型Matrigel的管形成实验来证明血管生成……

以下实验的总体目标是通过体外测定多种肿瘤细胞类型的成管能力，以评估其在体内的血管活性。该目标通过将肿瘤细胞接种到基质胶（matrigel）上以诱导成管形成来实现。这是第二步。将细胞接种于基质胶上，在37摄氏度条件下孵育过夜，以促进管状结构的形成。随后，对每种细胞类型形成的管状结构进行成像。为了定量分析每种细胞类型形成的平均管数，获取实验结果，以基于异种移植肿瘤模型评估这些细胞在体内形成血管系统的潜在能力。该方法有助于解答癌症研究领域中的一些关键问题，例如如何在体外测量血管活性。准备肿瘤细胞时，首先培养UAD7黑色素瘤、B16F1、MDA-MB-435或结肠HCT116细胞，使用添加10%胎牛血清（FBS）及青霉素的DMEM培养基进行培养。人微血管内皮细胞（HECs）则在EBM-2培养基中培养，培养基中添加1微克/毫升氢化可的松、1纳克/毫升表皮生长因子、10%胎牛血清（FBS）及青霉素。用 PBS 清洗细胞，然后用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 消化使细胞脱离，2000 RRP M 离心五分钟收集细胞，再用 PBS 洗涤一次。使用血细胞计数板计数细胞，以准备预温的基质胶。将一毫升生长因子减少的Matri Gel置于室温下。然后立即置于冰上10分钟。用移液器将50微升加入96孔板的孔中。将培养板在37摄氏度下孵育30分钟，用DMEM或eBM2分别重悬一至两个×10⁵个肿瘤细胞或内皮细胞，并将其接种至Matrigel的上层。若研究试剂对管状结构形成的影响，将试剂加入无血清培养基中，37摄氏度孵育过夜。进行图像分析时，加入10微升10%甲醛盐水溶液，作用10分钟。然后使用10倍物镜在相差显微镜下进行成像。从每个样本中随机选取三到五个视野，计数其中的管状结构数量，然后计算平均值。使用 HMCs 作为阳性对照，因为这些管状结构由清晰的长梭形细胞体连接形成多边形网络。B16F1、U87 和 MDA-MB-435 细胞形成的血管样管状结构与 HECs 形成的类似，但 HCT116 细胞则不能形成。在U 87细胞中检测了细胞剂量依赖性的管状结构形成。如本图所示，当细胞数量加倍后，10,000个细胞形成了不连续的管状结构。其形成的稳定血管网络可与H ecs中观察到的结构相媲美。相比之下，起始细胞数量少于5,000个时则无法形成血管表型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何成功建立Matrigel管形成实验，以体外检测癌细胞的成管能力。

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