吸收陷窝实验：一种利用磷酸钙包被培养板在体外定量成熟破骨细胞钙吸收活性的技术

破骨细胞，多核巨噬细胞，促进骨吸收 - 骨组织的分解和骨矿物质的释放。

为了在体外量化破骨细胞吸收，在巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF 中培养人外周血单核细胞，其中含有用于分化为破骨细胞祖细胞和附着的培养基。收获破骨细胞祖细胞并离心。

重悬的细胞悬液移液到补充有M-CSF和核因子κ-Β配体受体激活剂RANKL的培养基中，移液到涂有磷酸钙的多孔板孔中，模拟无机骨成分。M-CSF 和 RANKL 引起破骨细胞祖细胞分化并融合成破骨细胞，激活吸收。

活化的破骨细胞附着在磷酸钙涂层上，重组其细胞骨架以形成富含肌动蛋白的密封区，并形成褶皱状边界，分泌质子和酸性水解酶。由此产生的酸性环境溶解磷酸钙涂层，释放钙和磷酸根离子并形成吸收坑。

孵育后，清洗孔，去除溶解的离子。固定并透化破骨细胞以进行后续染色。用合适的染料染色肌动蛋白丝。用DNA结合染料复染细胞核。用钙结合染料染色孔涂层中的钙。

荧光显微镜下，功能性破骨细胞表现出多个荧光核和肌动蛋白环，这对于吸收功能至关重要。吸收坑在肌动蛋白环覆盖的荧光磷酸钙涂层上表现为黑色区域。

使用合适的软件，量化凹坑面积，确定破骨细胞吸收。

PBMC重悬于含有20ng / mL巨噬细胞集落刺激因子的完整α-MEM中，并在烧瓶中接种2.5 x 10⁵个细胞/ cm² PBMC。将磷酸钙包被板与50微升胎牛血清在37摄氏度下孵育一小时。

接下来，用PBS洗涤烧瓶两次，以将破骨细胞前体从死亡或非贴壁细胞中分离出来。然后，每 75 厘米² 烧瓶加入 4 毫升胰蛋白酶。30分钟后，通过加入4毫升完整的α-MEM停止消化。然后，使用细胞刮刀小心地分离细胞。

细胞转移到 50 毫升管中，并使用计数室计数细胞总数。将试管以 350 x g 离心 7 分钟以沉淀细胞，并将沉淀重悬于含有 M-CSF 和 RANKL 的完整 α-MEM 中，以获得 1 x 10⁶ 个细胞/mL。

从磷酸钙包被板中吸出胎牛血清，每孔移液200微升细胞悬液。孵育后，用PBS洗涤细胞两次。用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后用PBS再次洗涤。

对于染色，将透化缓冲液添加到固定细胞中，并孵育五分钟。

要染色肌动蛋白丝，将细胞与 100 微升 AlexaFluor 546 标记的鬼笔环肽溶液在 PBS 中孵育 30 分钟。然后，吸出染色溶液，并使用 100 微升 Hoechst 对细胞核进行染色 10 分钟。

用 100 微升 10 微摩尔钙黄绿素在 PBS 中染色磷酸钙涂层 10 分钟。用PBS洗涤三次后，捕获图像。