吸收陷窝实验：一种利用磷酸钙包被培养板在体外定量成熟破骨细胞钙吸收活性的技术

破骨细胞是一种多核巨噬细胞，可促进骨吸收——即骨组织的分解以及骨矿物质的释放。

为了定量分析体外破骨细胞的骨吸收活性，将人外周血单个核细胞在含有巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的培养基中进行培养，以诱导其分化为破骨细胞前体细胞并促进贴壁。收集破骨细胞前体细胞并离心。

用含有M-CSF和核因子κB受体活化因子的培养基重悬细胞悬液，用移液器吹打混匀Β 配体RANKL加入涂有磷酸钙（模拟无机骨成分）的多孔板孔中。M-CSF和RANKL诱导破骨细胞前体分化并融合形成破骨细胞，激活骨吸收。

活化的破骨细胞附着于磷酸钙涂层，重组其细胞骨架以形成富含肌动蛋白的封闭区，并发育出皱褶缘，后者分泌质子和酸性水解酶。由此产生的酸性环境溶解磷酸钙涂层，释放出钙离子和磷酸根离子，并形成骨吸收陷窝。

孵育结束后，洗涤各孔，去除溶解的离子。固定并通透破骨细胞，以备后续染色。使用合适的染料对肌动蛋白纤维进行染色。用DNA结合染料对细胞核进行复染。使用钙结合染料对孔板包被层中的钙进行染色。

在荧光显微镜下，具有功能的破骨细胞表现出多个荧光细胞核和肌动蛋白环，这对骨吸收功能至关重要。吸收陷窝表现为荧光磷酸钙涂层上被肌动蛋白环覆盖的黑色区域。

使用合适的软件定量分析陷窝面积，以确定破骨细胞的骨吸收活性。

用含有20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的完全α-MEM重悬PBMCs，并将2.5 × 10⁵ 个细胞/cm²的PBMCs接种至培养瓶中。将磷酸钙包被的培养板与50微升胎牛血清在37摄氏度下孵育1小时。

接下来，用 PBS 清洗锥形瓶两次，以去除死亡或未贴壁的破骨细胞前体细胞。然后，每 75 cm² 锥形瓶加入 4 毫升胰蛋白酶。30 分钟后，加入 4 毫升完全 α-MEM 培养基以终止消化。随后，使用细胞刮轻轻刮下细胞。

将细胞转移至50毫升离心管中，使用计数板对细胞总数进行计数。在350 × g 条件下离心7分钟，使细胞沉淀，然后将沉淀重悬于含有M-CSF和RANKL的完全α-MEM培养基中，调整细胞浓度至1 × 10⁶ 个细胞/毫升。

吸去包被有磷酸钙的培养板中的胎牛血清，每孔加入 200 微升细胞悬液。孵育后，用 PBS 洗涤细胞两次。用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，再用 PBS 洗涤一次。

染色时，向固定后的细胞中加入通透缓冲液，孵育五分钟。

为了染色肌动蛋白丝，将细胞与100 µL PBS中的AlexaFluor 546标记的鬼笔环肽溶液在室温下孵育30分钟。然后吸去染色液，并加入100 µL Hoechst染液染色细胞核10分钟。

用100微升含10微摩尔钙黄绿素的PBS溶液对磷酸钙涂层染色10分钟。用PBS洗涤三次后，采集图像。