单分子下拉分析法用于蛋白质磷酸化检测：一种高通量定量细胞裂解液中蛋白质磷酸化的技术

某些细胞蛋白的磷酸化对其生物学功能至关重要。

为了利用单分子下拉实验定量完整蛋白质的磷酸化水平，首先取一个带有网格阵列图案的玻璃盖玻片。每个区域均包被有生物素化的聚乙二醇（PEG）或基于PEG的连接分子，并间隔分布普通PEG，以防止蛋白质结合过程中产生空间位阻。

使用还原试剂处理盖玻片，以减少分析过程中的自发荧光。将中性链霉亲和素（Neutravidins，一种生物素结合蛋白）覆盖到盖玻片上并进行孵育，使其与生物素化的 PEG 连接子结合。

向阵列中添加针对目标蛋白的特异性抗体。每种抗体均含有连接至其 Fc 区域的生物素，该生物素有助于将抗体锚定在中性亲和素上，从而实现固定化。

现在加入含有多种蛋白质的细胞培养裂解液，其中包括绿色荧光标记的靶蛋白的磷酸化与非磷酸化形式，并进行孵育。靶蛋白的两种形式均会被抗体捕获，形成复合物。洗涤以去除未结合的蛋白质。

接下来，用第二组红色荧光标记的抗体处理这些复合物，这些抗体特异性结合蛋白的磷酸化残基，从而使复合物产生不同的荧光信号。

在荧光显微镜下对芯片进行成像，并观察两种不同的荧光信号。两种荧光信号的共定位表明样品中存在磷酸化蛋白。

从冰箱中取出生物素-PEG功能化芯片，并使其平衡至室温。将带有芯片的一面朝上放置于已铺有封膜的100毫米组织培养皿上。每块芯片区域加入10毫克/毫升的硼氢化钠和PBS溶液，在室温下孵育4分钟。用PBS洗涤三次。

接下来，在 T50 缓冲液中加入 0.2 毫克/毫升的 NeutrAvidin，孵育 5 分钟，随后用 T50-BSA 洗涤三次。再在 T50-BSA 缓冲液中加入 2 微克/毫升的生物素标记的靶蛋白特异性抗体，孵育 10 分钟，随后进行洗涤。

首先，通过移液操作解冻并混匀裂解液。取1微升裂解液加入100微升预冷的T50-BSA/PPI溶液中进行稀释。将稀释后的裂解液加入芯片中孵育10分钟，随后进行洗涤。用预冷的T50-BSA/PPI溶液配制AF647标记的抗磷酸化酪氨酸抗体，加入芯片中孵育1小时。

在物镜上滴加一滴油。将纳米网格置于载物台上进行成像。使用透射白光，聚焦到网格图案上。采集该网格的20幅连续图像。确保像素未达到饱和，并将图像序列保存为“Fiducial”。

将纳米网格失焦以形成艾里斑图案。采集20幅图像用于增益校准，并将图像保存为“增益”。然后，在完全遮挡进入相机的光线的情况下，采集20幅图像用于相机偏移校准，并将图像保存为“背景”。

为获取SiMPull图像，首先清洁油镜，并在物镜上添加额外的镜油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。对每个样品依次进行成像，先在远红光通道成像，随后对较短波长的荧光染料进行成像。每30至45分钟检查一次缓冲液液面，并根据需要补充缓冲液。