用于蛋白质磷酸化分析的单分子沉降测定:一种定量细胞裂解物中蛋白质磷酸化的高通量技术

0 views • 4:14 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

某些细胞蛋白的磷酸化对其生物学功能很重要。

要使用单分子下拉测定法量化完整蛋白质的磷酸化水平,首先取具有网格阵列图案的玻璃盖玻片。每个隔室都涂有生物素化聚乙二醇或与正常 PEG 间隔的基于 PEG 的接头,以防止蛋白质结合过程中的空间位阻。

用还原试剂处理盖玻片,以尽量减少分析中的自发荧光。用 Neutravidins(生物素结合蛋白)覆盖盖玻片并孵育,使它们能够结合生物素化的 PEG 连接子。

用特异性抗靶蛋白抗体补充阵列。每种抗体都含有与其 Fc 区域相连的生物素,有助于将抗体锚定在中性亲和素上,从而导致固定。

现在,加入含有各种蛋白质的细胞培养裂解物,包括目标蛋白的绿色荧光标记磷酸化和非磷酸化变体,并孵育。靶蛋白的两种变体都被抗体捕获,形成复合物。洗涤以去除未结合的蛋白质。

接下来,用第二组红色荧光标记抗体处理这些复合物,该抗体专门结合蛋白质的磷酸化残基,从而向复合物传递不同的荧光信号。

荧光显微镜下对阵列进行成像,并观察两个不同的荧光信号。两种荧光信号的共定位表明样品中存在磷酸化蛋白。

冰箱中取出生物素-PEG功能化阵列,并将其平衡至室温。将盖玻片放在衬有密封膜的 100 毫米组织培养皿上,阵列朝上。将阵列的每个方格与每毫升 10 毫克硼氢化钠和 PBS 在室温下孵育 4 分钟。用PBS洗涤三次。

接下来,在T50中与每毫升0.2毫克NeutrAvidin孵育5分钟,然后用T50-BSA洗涤三次。在T50-BSA中用每毫升2微克生物素化POI特异性抗体重复孵育10分钟,然后洗涤。

首先,通过移液解冻并混合裂解物。将 1 微升裂解物稀释到 100 微升冰冷的 T50-BSA/PPI 中。将裂解物在阵列上孵育 10 分钟,然后洗涤。在冰冷的T50-BSA / PPI中制备AF647偶联的抗磷酸酪氨酸抗体,并在阵列上孵育1小时。

物镜上滴一滴油。将纳米网格放在载物台上进行成像。使用透射白光,聚焦网格图案。获取一系列 20 张网格图像。确保像素不饱和,并将图像系列保存为"基准"。

焦纳米网格以创建 Airy 图案。采集一系列 20 张图像进行增益校准,并将图像保存为"增益"。然后,通过阻挡相机的所有光线来获取一系列 20 张图像进行相机偏移,并将图像保存为"背景"。

要获取SiMPull图像,首先,清洁油物镜,并在物镜上沉积额外的油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。获取每个样品的图像,首先在远红通道中获取图像,然后是较低波长的荧光团。每 30 至 45 分钟检查一次缓冲液液位,并根据需要补充。

12:47

核磁共振光谱法本质无序蛋白的磷酸化多元的鉴定

Related Videos

0 Views

10:26

化细胞穿透肽研究胞内蛋白-蛋白质相互作用

Related Videos

0 Views

07:26

从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白质裂解物以进行磷酸化蛋白分析

Related Videos

0 Views

15:41

脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

Related Videos

0 Views

11:13

激酶底物对鉴定使用高通量筛选

Related Videos

0 Views

09:16

寡肽竞争测定磷酸化位点测定

Related Videos

0 Views

07:42

用抗体阵列对信号转导通路的审问对酪氨酸激酶抑制剂的抗性评价

Related Videos

0 Views

08:38

磷流式细胞仪与荧光细胞条形码用于单细胞信号分析和生物标志物发现

Related Videos

0 Views

11:23

使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

Related Videos

0 Views

06:49

测量小核苷酸基质的多核苷酸磷酸化的非放射性测定

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026