0 次观看 • 4:25 分钟 • July 8th, 2025
在代谢活跃的细胞中，含碳底物被氧化 通过 一系列生化反应，用于产生能量并释放二氧化碳作为副产物。
为了确定底物氧化速率，首先准备所需的未分化细胞的贴壁培养物。在培养基中加入含有放射性碳14标记的合适底物，并进行孵育。
细胞消耗底物并将其氧化，释放出放射性标记的二氧化碳，后者从细胞中扩散至周围培养基中。
将该培养基转移至含有高氯酸的气体捕集装置中以终止反应。该试管内含一张浸有氢氧化钠的滤纸，置于试管帽内。盖紧管盖，并进行孵育。
孵育过程中，以气态形式存在的二氧化碳在试管内释放。氢氧化钠吸收放射性标记的二氧化碳，并将其截留在滤纸上。将此滤纸转移至含有闪烁液的样品瓶中，并将其放入液体闪烁计数器内进行检测。
计数器内部，放射性标记的碳发生放射性衰变，释放出高能β粒子。这些粒子被闪烁液组分吸收后发出光脉冲，闪烁计数器对这些光脉冲进行计数。
检测到的放射性强度与细胞中底物氧化速率成正比。
用DPBS洗涤额外孔中的细胞，每次洗涤重复两次。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离细胞。将20微升消化后的细胞重悬于DPBS中，并加入20微升吖啶橙和碘化丙啶染色液。使用自动细胞计数仪测定活细胞数量，并记录结果。
在检测孔中用DPBS洗涤细胞两次。在RAM指定的组织培养罩内，向每个检测孔加入500微升预热的培养基。用封口膜密封培养板后，于37摄氏度的RAM指定培养箱中孵育细胞4小时。
孵育期间，将滤纸剪成略大于1.5毫升微量离心管管盖内侧面积的圆形片状，将滤纸紧密地插入管盖中。向每根离心管中加入200 µL的1摩尔高氯酸，并向管盖内放置的滤纸上加入20 µL氢氧化钠。
孵育细胞后，将每孔中的400微升培养基转移至已准备好的离心管中，并立即盖紧管盖。将离心管置于室温下的试管架中静置1小时。
同时，在孵育过程中，为每个试管准备一个闪烁瓶，并加入4毫升闪烁液。将每一片滤纸转移至闪烁瓶中，在室温下孵育30分钟。
对组织培养罩、水浴锅、冰箱、培养箱、水槽、地面以及任何其他工作区域进行擦拭检测，以检查是否存在潜在的放射性污染。将擦拭纸放入含有闪烁液的闪烁瓶中。
使用闪烁计数器测量闪烁瓶中碳-14的放射性活度，并记录读数结果。如有必要，根据辐射安全指南对工作环境进行去污处理。