球形支撑脂双层实验：一种在微球上观察Septin组装的技术

Septins 是一类关键的细胞骨架蛋白，可结合弯曲的质膜表面。

为了观察微球上的体外（in vitro）septin 组装，首先取均匀大小的显微二氧化硅微珠悬浮液，作为双层结构形成的固相支持物。涡旋该悬浮液以打破任何微珠聚集体。

加入小单层囊泡（SUVs）——由单层脂质双分子层包围的球形囊泡。在持续振荡条件下孵育，防止微球沉淀。

孵育过程中，小单层脂质体（SUV）的外层极性头部基团促进其吸附到亲水性微球表面。这一相互作用导致SUV破裂，随后SUV的脂质在弯曲的微球表面融合形成连续的单层，最终形成球形支撑脂双层（SLB）。

洗涤以去除过量未结合的脂质，并在反应缓冲液中重悬。将球形支持性脂双层（SLB）悬浮液转移至聚乙二醇涂层表面的小区域，以防止非特异性吸附。向腔室中加入荧光标记的septin悬浮液并孵育。

Septins 形成异源寡聚体，能够识别球形支持性脂双层（SLBs）的正曲率，并聚合形成丝状结构。最终，Septins 丝状体相互作用，导致高级结构的形成。

在高分辨率荧光显微镜下观察被 septin 包被的 SLB。荧光的存在表明 septin 具有曲率敏感的沉积特性。

首先，将含有二氧化硅微球的瓶子涡旋振荡15秒。然后，水浴超声处理1分钟，再涡旋振荡15秒以打破任何聚集体。在低吸附性微量离心管中，将微球与SLBB及10 µL 5 mM SUVs混合。

将珠-脂质混合物在室温下于摇床上孵育一小时，以防止沉淀。在此期间，解冻一片聚乙二醇化盖玻片，并将一段切割好的0.2毫升PCR管粘附于其上。孵育结束后，在指定的相对离心力（RCF）下离心珠子30秒。

第一次离心后，移除50微升上清液。然后加入200微升PRB，并通过剧烈吹打混匀。在后续步骤中，第二次和第三次离心后各移除200微升PRB，并分别加入200微升新鲜PRB；第四次离心后加入220微升PRB。

若使用多种微珠尺寸进行竞争实验，需将每种尺寸的微珠取等体积混合，再取29 µL该微珠混合液与721 µL反应缓冲液稀释。然后，向各孔中加入75 µL稀释后的微珠和25 µL用SSB稀释的蛋白溶液，并混匀。

若要测量稳态下的 Septin，将混合物在室温下孵育一小时，然后通过近全内反射（near-TIRF）或共聚焦显微镜成像。