蛋白质相分离检测：一种用于斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中突变RNA结合蛋白相分离的光遗传学方法

细胞核RNA结合蛋白（RBPs）是多功能蛋白，由具有明确三维结构的有序区域和稳定性较差的内在无序区域（IDRs）组成。

在多种神经退行性疾病中，IDR 特异性突变导致 RBPs 错误定位至细胞质，并异常参与弱相互作用，形成动态的无膜包涵体——这一现象称为相分离。最终，这些包涵体成熟为有毒的不溶性聚集体，导致神经元功能障碍和变性。

研究RBP相分离 体内 使用光遗传学方法，从已脱膜并处于麻醉状态的转基因斑马鱼幼鱼开始，该幼鱼表达一种携带IDR突变的RNA结合蛋白，该蛋白与荧光报告分子及对蓝光敏感的光感受结构域相融合，置于适宜缓冲液中。

接下来，将幼虫侧向固定在熔化的琼脂糖液滴上，用于脊髓成像。待琼脂糖凝固，以固定幼虫。使用共聚焦显微镜采集脊髓图像，以观察定位于神经元细胞核内的荧光 RBPs。

现在，将幼虫从琼脂糖中取出，转移至含有缓冲液的多孔板中。将多孔板置于优化的蓝色发光二极管（LED）面板上，对幼虫进行光照。

在蓝光照射下，突变的RNA结合蛋白会错误定位至细胞质，在其中光感受结构域发生寡聚化并形成簇状结构，使RNA结合蛋白的内在无序区（IDRs）相互靠近，促进其自身缔合并形成无膜包被的包涵体。

光照后，将幼虫包埋于琼脂糖中，对其脊髓进行成像。荧光标记的 RBPs 在神经元胞质内呈现为分散的独立区室。

对于表达光遗传学TDP-43的斑马鱼幼鱼进行成像时，需对双转基因鱼进行去卵膜处理，并将其置于含有250微克每微升Tricane的E3缓冲液中麻醉。

接着，将含有 250 微克每微升三卡因甲磺酸盐（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate）的 1% 低熔点琼脂糖在 42 摄氏度下预热，然后在玻璃培养皿底部滴加一滴琼脂糖溶液。玻璃培养皿上形成的圆顶状琼脂糖液滴直径应为 8 至 10 毫米。

接下来，使用巴斯德吸管将麻醉后的斑马鱼加入玻璃底培养皿的琼脂糖中。尽量减少随鱼一同加入琼脂糖中的E3缓冲液体积。然后，通过反复吹打混合数次。

在琼脂糖凝固过程中，使用注射器针头将鱼体保持在侧卧位置，使脊髓处于适当的水平位置。琼脂糖完全凝固后，在呈圆顶状的琼脂糖包埋鱼体上滴加数滴 E3 缓冲液。

使用配备20倍水浸物镜的共聚焦显微镜，对脊髓进行连续的共聚焦z轴断层扫描。在感兴趣区域中包含鱼腹侧的泄殖腔，作为参考结构，用于识别和比较不同时间点的脊髓节段。

成像一完成，立即使用注射器针头小心敲碎琼脂糖，将斑马鱼从琼脂糖中取出。应尽量缩短斑马鱼在琼脂糖中的包埋时间，尽管包埋时间少于30分钟不会影响斑马鱼的存活率。

向6孔板的一个孔中加入7.5毫升E3缓冲液，并将已成像的双转基因鱼放入该孔中。然后将6孔板放置在LED面板上，使用间隔物使6孔板与LED面板之间保持5毫米的距离，并打开蓝色LED灯。

将一些双转基因鱼置于另一个6孔板中，并用铝箔覆盖，作为未照射的对照组。在完成所需的光照时间后，对已照射的鱼进行脊髓成像，操作方法如前所述。