蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

细胞内错误折叠蛋白的清除主要由细胞泛素-蛋白酶体系统调控，其中错误折叠蛋白首先被泛素（一种小分子调节蛋白）识别并标记，随后被转运至蛋白酶体（一种多蛋白复合物）进行水解和清除。

泛素-蛋白酶体系统功能受损是神经退行性疾病中的常见现象，可导致错误折叠的蛋白质在细胞内积聚，形成具有细胞毒性的不溶性蛋白聚集体。

可视化并定量分析蛋白质聚集 体外获取转导的哺乳动物细胞悬液——该细胞在适宜培养基中表达带有荧光标记的突变蛋白，该突变蛋白呈错误折叠构象并暴露出疏水残基。

将蛋白酶体抑制剂以逐渐增加的浓度加入到黑色多孔板的各孔中，以在成像过程中尽量减少背景荧光。将哺乳动物细胞悬液接种至各孔中。孵育，使细胞贴附于培养板底部并增殖。

进入细胞后，蛋白酶体抑制剂会结合到蛋白酶体的蛋白水解位点并抑制其活性，导致表达的突变蛋白积累，进而发生相互作用 通过 其暴露的疏水性残基并形成细胞质内聚集体，最终导致细胞死亡。

加入荧光DNA结合染料以染色细胞核。对培养板进行成像。荧光突变蛋白聚集体出现在未染色的细胞质中，呈分散状态。

蛋白酶体抑制剂浓度较高的孔中，蛋白质聚集体数量与细胞计数的比值高于蛋白酶体抑制剂浓度较低的孔。

对于化合物转移，在384孔聚丙烯储存板上，通过标准的1比3系列稀释法加入化合物的系列稀释液。然后，使用配备384通道毛细管头的液体处理仪，将0.25微升蛋白酶体抑制剂分配至空的黑色平底384孔检测板中。随后，接种1.5 × 10⁴ 将细胞接种于这些培养板上，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。

在对经蛋白酶体抑制剂处理的细胞系进行成像之前，加入10微升预热的含染色液DMEM，并在室温下孵育10分钟。

染色后，通过选择 “显微镜” 选项卡启动自动显微镜操作软件。首先选择 “配置” 选项卡，然后选择 20X 物镜和正确的板型。

为了使用不同类型的培养板时实现正确聚焦，请确保物镜上的“Collar”已设置为对应的正确数值。

接下来，选择“Exposure 1”，将焦平面高度设置为“0 micrometers”，然后选择“Focus”。聚焦完成后，对 Camera 1 进行曝光。

为优化曝光平面，调节焦面高度，然后点击“采集高度”。调整激光功率的曝光时间，使最大像素强度约为 3,000，并保存曝光参数。

选择 “实验定义” 选项卡。创建布局和子布局。接着，拖放相关的布局、曝光、参考图像、倾斜裁剪文件以及子布局。然后，保存实验。

最后，选择 “自动实验” 选项卡并采集图像。对于双通道图像，首先选择用于分割主要物体（如细胞核、细胞质和聚集体）的软件算法。