0 次观看 • 4:38 分钟 • July 8th, 2025
内毒素是存在于革兰氏阴性菌外膜上的细菌毒素，为脂多糖（LPS），主要由脂质和多糖组成，包括脂质A和O-抗原。在感染过程中释放后，可被免疫系统识别，从而触发基于细胞因子的炎症反应。
使用鲎试剂（LAL）检测法评估脂质体药物纳米制剂中的内毒素污染时，准备反应管，其中一管含有药物，另一管含有添加了已知浓度内毒素的药物。
加入含有从鲎（Limulus polyphemus）血细胞或变形细胞中提取的蛋白裂解物的鲎试剂（LAL试剂）。该裂解物包含非活性丝氨酸蛋白酶——因子B、因子C、前凝血酶以及一种凝胶凝固蛋白——凝固原（coagulogen）。
将试管涡旋振荡，然后放入浊度计中，测定溶液的浊度。
当存在与脂质体药物结合的污染性脂多糖（LPS）时，LPS敏感因子C会发生自催化激活，进而切割并激活因子B，后者将前凝血酶转化为凝血酶。该激活后的酶切割凝固原肽键，形成凝固素单体。
最终，单体发生聚合反应 通过 头部暴露的疏水区与另一分子的疏水尾部之间的相互作用，导致聚集并形成不溶性浑浊的凝胶素凝胶。所测得的浊度可用于确定纳米制剂中的内毒素浓度。
在可接受范围内，根据加标样品和测试样品中的内毒素浓度计算得出的加标回收率表明，纳米制剂无明显干扰，证实了纳米制剂药物中存在内毒素。
在制备校准标准品时，使用 900 微升鲎试剂（LAL）级水或鲎变形细胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate），加入 100 微升对照标准内毒素，根据需要配制足够数量的中间稀释液，以制备浓度为每毫升 1 个内毒素单位（EU/mL）的校准标准品。
然后，使用 900 微升 LAL 级水和 100 微升浓度为每毫升 1 个内毒素单位的校准标准品，配制第二份校准标准品，其浓度为每毫升 0.1 个内毒素单位。
然后，重复进行10倍系列稀释，以制备两个较低浓度的校准标准品，共获得四个浓度范围为0.001至1埃塔单位/毫升的校准标准品。
为制备0.05内毒素单位/毫升的质量对照品，将50微升浓度为1内毒素单位/毫升的对照标准内毒素溶液与950微升LAL级水混合。
接下来，在软件中选择“仪器设置”，并创建模板。选择“采集数据”，然后在“常规”选项卡中输入测试编号和数据组。在“硬件”选项卡下，选择仪器类型和LAL方法，并确认屏幕上显示有序列号、系统ID以及串口信息。
单击“确定”两次，以确认仪器选择及与仪器的通信，并按照样品将被检测的相同顺序输入样品编号。然后，使用默认按钮输入阴性对照、标准曲线和待测样品。
将适量的阴性对照校准标准品和质控品加入已预先标记的玻璃试管中，每个浓度设两个复孔，并向第一个测试小瓶中加入适量的鲎试剂（LAL）。短暂涡旋混匀小瓶，然后将其放入仪器转盘中的相应测试孔位。
在加样前，按照所示方法，在最大有效稀释倍数范围内对测试纳米材料进行多次稀释。