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碳水化合物降解酶将复杂的多糖分解为较小的寡糖。
为了筛选酶的降解活性,首先取多种经染色的多糖氯三嗪染料制备而成的显色聚合物水凝胶(CPH)。每种多糖随后通过化学交联形成水凝胶——作为酶促降解的合成底物。
现在,将不同的CPH底物分别加入多孔反应板的不同孔中。加入激活溶液并进行孵育,以确保底物得到充分激活。
将检测板置于空的产品板上方,共同以低速离心,以促进活化溶液通过反应板的孔隙高效移除。
接下来,向反应板的所有孔中加入相同类型的碳水化合物降解酶,并置于适当的缓冲液中,以维持酶活性所需的最适 pH 值。密封反应板并在轻微振荡条件下孵育,使酶均匀分布于聚合物网络中,从而能够接触底物。
孵育过程中,具有相应底物活性的酶将CPH中的多糖降解为较小的染料连接寡糖。这些产物可溶,使溶液呈现颜色。离心反应板,将有色溶液收集至产物板中。
通过分光光度法测定产物吸光度以测量酶活性。
首先,通过向每个孔中加入 200 微升活化溶液来活化 96 孔滤膜分析试剂盒板。在室温下静置孵育 10 分钟,无需振荡。
使用离心机和任何标准的96孔板收集现有活化溶液并进行离心。向显色聚合物水凝胶(CPH)底物中加入100 µL无菌水,并通过抽真空或离心去除稳定剂。重复洗涤两次。
为准备酶反应,向检测试剂盒板的每个孔中加入 150 微升 100 毫摩尔的乙酸钠缓冲液(pH 4.5)以及 5 微升三种不同浓度的endo-纤维素酶溶液。
将产品板置于检测试剂盒板下方,以收集振荡过程中反应板可能产生的泄漏液体。然后,将检测试剂盒板置于水平摇床中,在室温下以 100 RPM 振荡 30 分钟。
为了获得可靠的数据,在孵育过程中必须对反应混合物进行振荡。
将检测试剂盒板置于产物板上方,放入离心机中,在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟,使反应产物转移至产物板的孔中。
离心后,目视检查产物板,确保每个孔中的液体体积大致相同。使用酶标仪,在630纳米波长下检测收集板中不同绿色CPH底物的吸光度。