基于不溶性显色生物质的酶筛选：一种评估植物生物质降解酶降解活性的检测方法

生物质是一种来源于植物的有机物质，主要由复杂的多糖组成。降解碳水化合物的酶作用于这些多糖，生成较小的寡糖。

为了评估一种酶的降解活性，首先取多孔反应板各孔中含有的不同不溶性染色生物质（ICB）底物。这些底物是通过使用特定的氯三嗪染料对植物来源材料进行染色而获得的。所得生物质含有染料标记的复杂多糖，可作为酶活性的底物。

现在加入含有碳水化合物水解酶的缓冲溶液。该缓冲液可维持酶活性所需的最适pH。将反应板置于摇床中孵育。持续振荡可使酶分子充分接触ICB底物中的目标多糖。

孵育过程中，水解酶切断长链多糖内部的共价糖苷键。该反应产生与染料分子相连的可溶性寡糖，这些寡糖仍保留在溶液中。

降解完成后，将反应板置于产物板上方，离心该组装装置。离心过程中，含有反应产物的有色溶液穿过反应板底部的滤膜，收集至产物板中。使用酶标仪测定上清液的吸光度。

较高的吸光度值表示生成了大量染料标记的寡糖，表明该酶降解ICB底物的效率较高。

使用红色不溶性显色生物质（ICB-小麦秸秆）进行显色测定实验时，首先向测定板的每个孔中加入200微升活化溶液。然后将板在室温下孵育10分钟，期间不进行振荡。

使用 100 微升无菌水洗涤孔三次，以去除稳定剂。然后，加入 150 微升 100 毫摩尔的醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 5 微升不同浓度的 10 单位/毫升的endo-木聚糖酶溶液。

将产物板置于底物板下方，以收集振荡过程中底物板可能产生的泄漏液体，并在室温下以 100 RPM 振荡孵育反应 2 小时。

孵育结束后，将检测试剂盒板置于离心机中，其下方放置产物板，以2,700 × g 离心10分钟，使反应产物转移至产物板的各孔中。

检查每个孔中的液体体积是否大致相同。然后，使用酶标仪在517纳米波长下测定收集板中红色ICB-小麦秸秆的吸光度。