溶血试验：一种体外测定钙离子载体诱导人红细胞裂解的方法

溶血是指红细胞破裂，将其细胞内含物释放到周围空间的过程。

为了检测溶血，首先准备一个含有红细胞的试管，其中红细胞悬浮于无葡萄糖但含有电解质的等渗溶液中，该溶液相对于体液为等渗。此溶液可保持红细胞的完整性，而缺乏葡萄糖则会诱导细胞产生应激反应。这将激活阳离子通道，促使钙离子进入细胞的胞质空间。

加入含有最佳浓度钙离子载体的溶液，该载体可结合钙离子并促进其转运至胞质溶胶，导致红细胞内钙离子超载。 

这种内流会激活翻转酶（scramblase），这是一种在质膜的脂质单层之间转运磷脂的蛋白质，从而破坏其不对称性。这一现象还会将位于内层单层的磷脂酰丝氨酸转运至外层单层，这是红细胞程序性死亡（即红细胞凋亡，eryptosis）的一个标志。

胞质内钙离子浓度升高会激活钾离子通道，促使钾离子排出细胞。由此产生的渗透压失衡导致水分流失，使红细胞皱缩。长时间暴露于钙离子载体可诱导溶血，造成血红蛋白泄漏至溶液中。

离心红细胞悬液，测定上清液的吸光度，以定量溶血红细胞释放的血红蛋白量。

将1毫克离子霉素-钙盐溶解于630微升DMSO中，以获得2毫摩尔的终浓度。分装为20微升每份，于-20摄氏度保存。

取1毫升已制备的0.4%红细胞压积，加入0.5微升2毫摩尔的离子霉素，使终浓度达到1微摩尔。在37摄氏度下孵育2小时。以1毫升未加离子霉素处理的红细胞压积作为阴性对照。将经离子霉素处理和未处理的红细胞压积在室温下以700 × g 离心5分钟，弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。

用1.5毫升林格氏液重悬细胞沉淀，以700 × g离心，重复洗涤细胞三次 g 室温孵育5分钟，弃去上清液。

为测量溶血，将1毫升未经处理的0.4%红细胞压积加入微量离心管中，并在37摄氏度孵育2小时，作为0%溶血的阴性对照。

为了制备100%溶血的阳性对照，将1毫升未经处理的0.4%红细胞压积加入微量离心管中，在室温下以700 × g 离心5分钟。移除上清液，向细胞沉淀中加入1毫升蒸馏水以重悬细胞，并在37摄氏度下孵育2小时。

接下来，将1毫升经离子霉素处理的0.4%红细胞压积液加入一个微量离心管中。在室温下，以700 × g 离心5分钟，分别处理未处理的细胞、经处理的细胞以及置于蒸馏水中的细胞。

将200微升上清液转移至96孔板的每个孔中。使用酶标仪在541纳米处测定吸光度。

使用以下公式计算溶血率，其中 A0、A100 和 AT 分别为红细胞在林格氏液中的吸光度、在水中的吸光度以及经离子霉素处理后红细胞的吸光度。