Annexin V 结合测定:一种通过磷脂酰丝氨酸标记鉴定凋亡红细胞的基于荧光的技术

在某些病理条件下，红细胞或红细胞会发生细胞收缩，并伴有膜磷脂-磷脂酰丝氨酸--从内膜小叶向外膜小叶易位，导致程序性细胞死亡、红斑病，引发巨噬细胞介导的细胞吞噬作用。

要通过膜联蛋白 V 结合测定测量离子人红细胞群中离子载体诱导的红细胞病，首先将红细胞悬浮在无葡萄糖缓冲液中。

葡萄糖耗竭会诱导细胞应激，激活胞质蛋白激酶 C，从而激活钙通道并引起钙离子流入。此外，钾通道被激活，导致钾外流和细胞收缩。

接下来，加入钙离子载体，与细胞外钙离子形成稳定的复合物。该复合物促进钙离子通过细胞膜进入胞质，进一步增加细胞内钙浓度。这反过来又激活了加扰酶（一种双向磷脂转运蛋白），有助于磷脂酰丝氨酸从细胞膜内小叶易位到外细胞膜小叶，减少膜不对称并诱导红斑病。

心离子载体处理的红细胞。将细胞重悬于含钙结合缓冲液中。加入荧光染料偶联膜联蛋白V溶液。

钙依赖性磷脂结合蛋白膜联蛋白 V 具有高磷脂酰丝氨酸亲和力，与外细胞膜小叶上暴露的磷脂酰丝氨酸残基结合。

使用荧光激活的细胞分选，根据膜联蛋白 V 荧光强度分离红细胞群。红细胞变着性红细胞比健康红细胞表现出更高的膜联蛋白V荧光强度。

8毫升PBS中稀释2毫升5X膜联蛋白V结合缓冲液，得到1X结合缓冲液。将离子霉素处理和未处理的细胞沉淀重悬于 1 毫升 1X 结合缓冲液中。

结合缓冲液中取 235 微升细胞悬液，并在微量离心管中加入 15 微升膜联蛋白 V-Alexa Fluor 488 偶联物。将细胞在室温下在黑暗的地方孵育20分钟。

室温下以700×g离心5分钟。除去上清液。通过将细胞沉淀悬浮在 1.5 毫升的结合缓冲液中，并在室温下以 700 x g 离心 5 分钟，用 1X 结合缓冲液洗涤细胞两次。

除去上清液并将细胞沉淀重悬于 250 微升 1X 结合缓冲液中，用于流式细胞术测量。现在，将 200 微升膜联蛋白 V 染色的红细胞转移到与流式细胞术兼容的 1 毫升圆底聚苯乙烯管中。

登录流式细胞术软件并单击"新建实验"按钮。单击"新管"按钮，选择"全局表"，然后选择"应用分析"以测量激发波长为 488 纳米、发射波长为 530 纳米的荧光强度。

将要收集的细胞数量设置为 20,000 个，用于荧光激活细胞分选分析。选择所需的管子并单击"加载"按钮。单击"记录"按钮进行前向散射和侧向散射测量。对所有样品重复上述步骤。

右键单击"标本"按钮，然后单击"应用批量分析"以生成结果文件。右键单击"样品"按钮，然后单击"生成 FSC 文件"。