体外葡萄糖消耗检测：一种基于荧光法通过测定细胞外葡萄糖消耗量来定量细胞葡萄糖摄取的方法

葡萄糖作为细胞的主要能量来源，通过细胞膜上的葡萄糖转运蛋白进入细胞。葡萄糖在细胞质中被分解为丙酮酸， 通过 糖酵解途径，通过三磷酸腺苷（ATP）为细胞代谢产生能量。

为检测细胞内葡萄糖摄取，首先在多孔板中培养贴壁的成纤维细胞。更换为无葡萄糖培养基并进行孵育。细胞将代谢现有葡萄糖以产生能量，从而达到葡萄糖饥饿状态。

将其中一组孔中的培养基更换为不含葡萄糖但含有胰岛素（一种葡萄糖摄取刺激剂）和荧光脱氧葡萄糖（一种葡萄糖类似物）的培养基。另一组孔则用仅含荧光脱氧葡萄糖的无葡萄糖培养基处理。

孵育期间，在无葡萄糖存在的条件下，胰岛素可促进更多的葡萄糖转运蛋白转位至质膜，从而增加荧光脱氧葡萄糖的摄取。

脱氧葡萄糖被细胞磷酸化后不再进一步代谢。同时，细胞外荧光脱氧葡萄糖的浓度降低。

孵育结束后，收集含有未利用荧光标记脱氧葡萄糖的培养基。用裂解缓冲液处理细胞。缓冲液中的去污剂形成胶束并溶解细胞膜，导致细胞内物质释放。

使用微孔板读数仪，测定含有细胞内荧光脱氧葡萄糖的细胞匀浆以及含有未利用的细胞外荧光脱氧葡萄糖的培养基的荧光。

与未刺激的细胞相比，经胰岛素刺激的成纤维细胞表现出细胞内荧光脱氧葡萄糖摄取增加，同时细胞外荧光脱氧葡萄糖相应减少。

每种模拟条件下使用 8 个重复样本，因此每种模拟条件需准备 1 毫升溶液。

使用7种无胰岛素的模拟条件：在一块96孔板中分别设置FD-葡萄糖浓度为2.5微克/毫升、1微克/毫升、0.5微克/毫升、0.2微克/毫升、0.1微克/毫升、0.05微克/毫升和0毫克/毫升。

在另一块96孔板中，使用7种含胰岛素的刺激条件：FD-葡萄糖浓度分别为2.5微克/毫升、1微克/毫升、0.5微克/毫升、0.2微克/毫升、0.1微克/毫升、0.05微克/毫升和0微克/毫升。

为准备刺激条件，取1微升浓度为5毫克/毫升的FD-葡萄糖工作液，与999微升无葡萄糖DMEM混合，得到1毫升工作储备液。

使用该工作液，立即在生物安全柜（无光照条件下）中配制 FD-葡萄糖的 1:2000、1:5000、1:10000、1:25000、1:50000 和 1:100000 稀释液，分别得到每毫升含 2.5 微克、1 微克、0.5 微克、0.2 微克、0.1 微克、0.05 微克的溶液，分装至 2 毫升离心管中。向每种条件中加入 1 微升胰岛素。

孵育40分钟后，从96孔板的每个孔中倾倒出无葡萄糖的DMEM，并用无菌纸巾吸去残留液体。将之前所述不同处理条件的溶液各取100微升，分别加入96孔板中同一列的各孔内；同一行各孔则加入相同处理条件的溶液，每孔100微升。对使用胰岛素和未使用胰岛素条件的培养板进行标记。

向对照孔中仅加入无葡萄糖的DMEM。将培养板置于细胞培养箱中避光孵育40分钟。

细胞刺激40分钟后，将两块培养板中的刺激培养基转移至新的96孔板中，保持相同的实验布局。用PBS洗涤细胞，吸去PBS，并将残留液体在无菌纸巾上倾倒除去。

向放射免疫沉淀分析缓冲液中加入蛋白酶抑制剂以保护蛋白质。将含有放射免疫沉淀分析缓冲液的培养板置于摇床中摇晃30分钟。

使用微孔板读板仪，分别在激发波长485纳米和发射波长535纳米条件下，首先测定含有细胞外FD-葡萄糖的培养基中的荧光，然后测定经放射免疫沉淀法裂解细胞的培养板在30分钟孵育结束后的荧光。