滑动肌动蛋白丝检测：一种体外运动检测法，用于研究肌动蛋白丝在固定化肌球蛋白上的易位

肌球蛋白——一种马达蛋白——与另一种丝状蛋白肌动蛋白相互作用，导致其发生易位。

为了分析肌动蛋白的滑动运动，构建一个基于玻璃载玻片的流动室，使流动室顶部内表面涂有硝酸纤维素。将肌球蛋白通过流动室注入，使其固定在硝酸纤维素涂层上。

向腔室中加入未标记的肌动蛋白丝——黑色肌动蛋白，并添加含有三磷酸腺苷（ATP）分子的运动缓冲液。

肌动蛋白丝会结合固定化的活性肌球蛋白，以及非活性或失活的肌球蛋白。ATP分子与活性肌球蛋白相互作用，导致其从黑色肌动蛋白上解离，而非活性肌球蛋白则仍与肌动蛋白结合。

离心以沉淀与黑色肌动蛋白结合的失活肌球蛋白。用缓冲液充分洗涤，以去除失活的肌球蛋白沉淀物、游离的肌动蛋白丝以及未使用的ATP。引入荧光标记的肌动蛋白，使其与固定化的活性肌球蛋白结合。

向反应室中加入终末缓冲液，其中含有拥挤剂——甲基纤维素和ATP。拥挤剂可迫使肌动蛋白丝更靠近反应室表面。

每个有活性的肌球蛋白水解ATP，导致构象改变并结合到细丝上的新位置，产生动力冲程，使肌动蛋白在肌球蛋白上滑动。

在荧光显微镜下观察样品室，记录标记的肌动蛋白丝在固定的肌球蛋白头部上平滑滑动的运动，以确认转位成功。

首先，配制 1% 硝酸纤维素的乙酸戊酯溶液，并将直径为 125 毫米的圆形滤纸置于组织培养皿底部。

将8个方形盖玻片装入支架中，先用约2至5毫升的无水乙醇彻底清洗，再用2至5毫升的蒸馏水冲洗。然后使用过滤的压缩空气或氮气管线将盖玻片完全吹干。

用移液器缓慢地将10微升1%硝酸纤维素溶液沿一个盖玻片的一边加入。使用200微升移液器吸头的侧面，以一次平滑的动作将溶液涂布至盖玻片其余部分。然后将该盖玻片放置于组织培养皿中，硝酸纤维素面朝上。对剩余的盖玻片重复此操作，并使其干燥。

用光学镜片纸擦拭显微镜载玻片，以清除较大的碎屑。剪下两段双面胶，每段长约2厘米，将其中一段沿显微镜载玻片长边的中线位置粘贴。将第二段胶带粘贴在第一段下方约2毫米处，使两段胶带相互平行，形成一个可容纳约10 µL溶液的流动腔室。

小心地将一张硝酸纤维素盖玻片粘贴到胶带上，确保涂有硝酸纤维素的一侧与胶带直接接触。

使用移液器吸头轻轻按压盖玻片与胶带的接触面，以确保盖玻片已牢固粘附在载玻片上。然后，用刀片将悬垂在载玻片边缘外的多余胶带剪去。

配制肌球蛋白-5a溶液，并置于冰上保存。将10微升肌球蛋白-5a溶液注入载玻片流动室中，静置1分钟。随后，注入10微升含DTT的运动缓冲液中含1毫克/毫升BSA的溶液。重复此步骤两次，第三次洗涤后静置1分钟。

用纸巾或滤纸的一角轻轻接触流动室出口，通过毛细作用将溶液引过通道。然后，用 10 µL 含 DTT 的运动缓冲液进行清洗。

使用1毫升注射器和27号针头吸取黑色肌动蛋白溶液，以剪切肌动蛋白丝，然后将溶液加入样品池中。在50毫摩尔MB缓冲液含1毫摩尔ATP和1毫摩尔DTT的条