0 次观看 • 3:39 分钟 • July 8th, 2025
肌球蛋白是一种运动蛋白，具有球状头部结构域，可与丝状蛋白肌动蛋白相互作用。这种相互作用对于肌球蛋白沿肌动蛋白丝的移位至关重要。为研究这一结合过程 体外进行肌球蛋白在表面固定的肌动蛋白上的倒置运动性测定。
首先，通过将经生物素化聚乙二醇（PEG）包被的盖玻片放置在显微镜载玻片上组装一个检测室，使包被面朝向内部，形成检测室的顶部。
将含有亲和素（一种糖蛋白）的溶液通过反应室。亲和素可高亲和力地结合生物素，从而增强肌动蛋白的黏附。接着，引入用红色荧光染料标记的生物素标记肌动蛋白丝。生物素配体与亲和素结合，使肌动蛋白丝固定在盖玻片表面。
最后，在含有三磷酸腺苷（ATP）分子的缓冲液中加入绿色荧光蛋白标记的肌球蛋白5A蛋白。具有前导头和尾随头的双头肌球蛋白5A与固定的肌动蛋白丝相互作用。肌球蛋白的尾随头与ATP结合，并从肌动蛋白上解离。
ATP的水解产生一次动力冲程，使后随的头部能够结合到肌动蛋白丝上位于前导头部前方的位置。通过连续的动力冲程，肌球蛋白沿着固定的肌动蛋白丝移动而不脱离。
利用荧光显微镜，记录绿色肌球蛋白分子在红色肌动蛋白丝上的运动。
配制肌球蛋白5a倒置运动性测定所需的溶液，并将它们置于冰上保存。
用含DTT的运动缓冲液冲洗腔室，每次10微升。加入10微升含有1毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的含DTT运动缓冲液。重复此步骤两次，在第三次冲洗后等待一分钟。将滤纸或组织纸的一角轻轻置于流动室出口处，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。
然后，用含DTT的运动缓冲液冲洗流动池三次，每次10微升。加入10微升含DTT的运动缓冲液配制的NeutrAvidin溶液，孵育一分钟。随后，用该溶液冲洗三次，每次10微升。
使用大孔径移液器吸头，加入含有 DTT 的 10 微升含 bRh-肌动蛋白的运动缓冲液，孵育 1 分钟。随后，用含 DTT 的运动缓冲液洗涤 3 次，每次 10 微升。
加入30微升终末缓冲液（含10纳摩尔肌球蛋白5a）进行流动，并立即加载到全内反射荧光显微镜上。当找到TIRF成像的最佳焦距后，开始记录。