基于ATP的荧光素酶活力检测法：一种均相评估受试药物对肿瘤类器官生长抑制潜力的方法

三磷酸腺苷（ATP）是细胞的主要能量来源，对多种细胞功能至关重要。在应激条件下，细胞内ATP水平会受到负面影响，因此ATP可作为代谢活跃且具有活力的细胞的良好标志物。

首先，将肿瘤细胞悬液接种至黑色壁、透明底的微孔板中，以在光强度测量期间尽量减少光散射。该微孔板具有水凝胶涂层，可防止细胞贴附于板壁，从而促进细胞间的相互作用并自组装形成肿瘤类器官——即模拟肿瘤微环境的三维组织培养物。

接下来，用待测化合物进行处理。该待测化合物与类器官细胞相互作用，根据其抑制生长的潜力，可能会破坏产生能量的代谢过程，导致细胞内ATP耗竭。

处理后，加入含有去垢剂、ATP酶抑制剂、荧光素酶、荧光素酶特异性底物荧光素以及镁离子的一步法试剂。孵育所需时间。

去垢剂可溶解细胞膜，导致细胞裂解并将ATP释放到溶液中，同时ATP酶抑制剂可使释放的内源性ATP酶失活，从而稳定ATP。

提取后，在镁离子存在的条件下，ATP可促进荧光素与荧光素酶结合，进而将荧光素氧化为高能态的氧荧光素，后者在弛豫过程中释放出一个生物发光光子。

使用光度计测量由光子产生的光强度，该强度可代表细胞内的ATP浓度。ATP含量越低，表明细胞活力越低，提示受试化合物具有更强的生长抑制潜力。

更换培养基24小时后，使用配备带有70微米孔径滤膜的滤器支架的细胞破碎与分散仪器，将肿瘤类器官进行切碎处理。将15毫米的肿瘤类器官悬液稀释10倍。

使用细胞悬液分配器将40微升稀释后的肿瘤类器官悬液接种至384孔超低吸附球状微孔板中。

24小时后，使用液体处理设备将10个连续稀释浓度的待测试剂溶液各0.04微升加入孔板中，终浓度范围为20微摩尔至1.0纳摩尔，随后将孔板孵育6天。

孵育结束后，在测试孔中加入细胞内 ATP 检测试剂。使用振荡器混匀板内各孔内容物，并在约 25°C 条件下孵育 10 分钟。使用酶标仪通过化学发光法测定细胞内 ATP 含量。