荧光探针成像测定:一种可视化活性氧诱导剂处理的培养肠道类器官细胞中氧化应激的技术

0 次观看3:28 分钟 • July 8th, 2025

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肠道类器官概括了肠状隐窝绒毛组织,其中心腔由死细胞和碎片组成。管腔内衬有绒毛状细胞和含有干细胞的出芽隐窝状突起。

不同的类器官细胞产生不同水平的活性氧,活性氧 - 代谢活动的副产物,其积累会导致氧化应激。

要可视化各种细胞中的氧化应激,首先在基底基质中取一个含有培养的 3D 类器官的多孔板。类器官干细胞表达绿色荧光蛋白或 GFP 标记蛋白,有助于在成像过程中区分它们。

用叔丁基氢过氧化物(一种ROS诱导剂)补充孔并孵育。诱导剂激活膜结合的 NADPH 氧化酶并刺激细胞内 ROS 的产生。干细胞具有代谢活性,比分化细胞产生更多的活性氧。

添加 ROS 敏感荧光探针。这些亲脂性探针迅速进入细胞并与ROS反应产生红色荧光。用选择性染色活细胞核的Hoechst染料处理类器官。使用共聚焦显微镜对类器官进行成像。

具有

染色细胞核的外围类器官细胞表现出不同程度的红色荧光,在表达GFP的干细胞中较高,在分化细胞中较低。具有固有高 ROS 水平的死细胞在管腔中表现出红色荧光。

红色荧光的强度与不同细胞类型中不同水平的氧化应激相关。

为了通过共聚焦显微镜可视化氧化应激,在铺有类器官的微载玻片八孔室的相应孔中加入1微升N-乙酰半胱氨酸储备溶液。

孵育1小时后,在相应的孔中加入1微升叔丁基氢过氧化物储备溶液,再孵育30分钟。接下来,每孔加入 1 微升荧光探针的 1.25 毫摩尔稀释液,然后加入 1 微升每毫升 1.25 毫克 Hoechst 溶液。

再孵育 30 分钟后,在不干扰 BMM 的情况下取出培养基,并轻轻加入 250 微升不含酚红的温 DMEM。

使用共聚焦显微镜对类器官进行成像,共聚焦显微镜配备了热室和检测荧光探针的气体供应。

使用阳性对照,设置 ROS 信号的激光强度和时间曝光,并检查该信号在负性对照中是否较低。接下来,使用目镜筛选载玻片以识别表达GFP的类器官,并调整激光强度。

设置一个 25 微米的 z 堆栈,并定义位置以获得整个类器官的拼接图像,以获得显示一层细胞的类器官的一部分。

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最后更新:1 八月 2026