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肠道类器官重现了类似肠道的隐窝-绒毛结构,具有一个包含死亡细胞和碎片的中央腔。该腔由绒毛样细胞排列,并带有包含干细胞的芽状、隐窝样突起。
不同的类器官细胞产生不同水平的活性氧(ROS),ROS 是代谢活动的副产物,其积累会导致氧化应激。
为了在多种细胞中可视化氧化应激,首先取一个含有在基底膜基质中培养的三维类器官的多孔板。类器官干细胞表达绿色荧光蛋白或带有GFP标签的蛋白,这有助于在成像过程中识别它们。
加入叔丁基过氧化氢(一种活性氧诱导剂)处理各孔,并进行孵育。该诱导剂可激活膜结合型NADPH氧化酶,刺激细胞内活性氧的产生。由于干细胞代谢活跃,其活性氧的产量高于分化细胞。
加入对活性氧敏感的荧光探针。这些亲脂性探针可快速进入细胞,并与活性氧反应产生红色荧光。用Hoechst染料处理类器官,该染料可选择性地染色活细胞的细胞核。使用共聚焦显微镜对类器官进行成像。
外周类器官细胞的细胞核经染色后显示出不同程度的红色荧光,其中表达GFP的干细胞红色荧光较强,而分化细胞的红色荧光较弱。腔内固有ROS水平较高的死细胞也表现出红色荧光。
红色荧光的强度与不同类型细胞中的氧化应激水平变化相关。
为了通过共聚焦显微镜观察氧化应激,向已接种类器官的八孔腔室载玻片的相应孔中加入1微升N-乙酰半胱氨酸储备溶液。
孵育1小时后,在相应的孔中加入1微升过氧化叔丁基原液,再孵育30分钟。接着,每孔加入1微升浓度为1.25毫摩尔的荧光探针稀释液,随后加入1微升浓度为1.25毫克/毫升的Hoechst溶液。
再次孵育30分钟后,移除培养基,注意不要扰动BMM,然后轻轻加入250微升不含酚红的预热DMEM。
使用配备有温控培养室和气体供应系统的共聚焦显微镜对类器官进行成像,以检测荧光探针信号。
使用阳性对照设置激光强度和ROS信号的曝光时间,并确认该信号在阴性对照中较低。接着,使用目镜扫描玻片以识别表达GFP的类器官,并调整激光强度。
设置 25 微米的 z 轴层扫,定义成像位置以获取整个类器官的拼接图像,从而获得显示单层细胞的类器官切片。