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肠道类器官概括了肠状隐窝绒毛组织,其中心腔由死细胞和碎片组成。管腔内衬有绒毛状细胞和含有干细胞的出芽隐窝状突起。
不同的类器官细胞产生不同水平的活性氧,活性氧 - 代谢活动的副产物,其积累会导致氧化应激。
要可视化各种细胞中的氧化应激,首先在基底基质中取一个含有培养的 3D 类器官的多孔板。类器官干细胞表达绿色荧光蛋白或 GFP 标记蛋白,有助于在成像过程中区分它们。
用叔丁基氢过氧化物(一种ROS诱导剂)补充孔并孵育。诱导剂激活膜结合的 NADPH 氧化酶并刺激细胞内 ROS 的产生。干细胞具有代谢活性,比分化细胞产生更多的活性氧。
添加 ROS 敏感荧光探针。这些亲脂性探针迅速进入细胞并与ROS反应产生红色荧光。用选择性染色活细胞核的Hoechst染料处理类器官。使用共聚焦显微镜对类器官进行成像。
具有
染色细胞核的外围类器官细胞表现出不同程度的红色荧光,在表达GFP的干细胞中较高,在分化细胞中较低。具有固有高 ROS 水平的死细胞在管腔中表现出红色荧光。
红色荧光的强度与不同细胞类型中不同水平的氧化应激相关。
为了通过共聚焦显微镜可视化氧化应激,在铺有类器官的微载玻片八孔室的相应孔中加入1微升N-乙酰半胱氨酸储备溶液。
孵育1小时后,在相应的孔中加入1微升叔丁基氢过氧化物储备溶液,再孵育30分钟。接下来,每孔加入 1 微升荧光探针的 1.25 毫摩尔稀释液,然后加入 1 微升每毫升 1.25 毫克 Hoechst 溶液。
再孵育 30 分钟后,在不干扰 BMM 的情况下取出培养基,并轻轻加入 250 微升不含酚红的温 DMEM。
使用共聚焦显微镜对类器官进行成像,共聚焦显微镜配备了热室和检测荧光探针的气体供应。
使用阳性对照,设置 ROS 信号的激光强度和时间曝光,并检查该信号在负性对照中是否较低。接下来,使用目镜筛选载玻片以识别表达GFP的类器官,并调整激光强度。
设置一个 25 微米的 z 堆栈,并定义位置以获得整个类器官的拼接图像,以获得显示一层细胞的类器官的一部分。